Detección de ARNiTengo un conjunto de datos de RNAi con 3 réplicas técnicas que se realizó por triplicado.Por ejemplo:
Ejecutar 1
gen X 45
gen X 59
gen X 51
Control 90
Ejecutar 2
gen X 145
gen X 159
gen X 151
Control 190
Ejecutar 3
gen X 35
gen X 39
gen X 31
Control 50
El conjunto de datos real tiene cientos de genes y docenas de controles por experimento. Cada corrida tiende a variar en su promedio, pero los experimentos fueron los mismos. Creo que esto se debe a la humedad de la habitación, pero al final no importa. Mi interés está en los genes, no en la variación de ejecución. Básicamente, quiero ver qué genes varían del control y una probabilidad (¿valor de p?). ¿Cuál es el mejor enfoque para analizar estos datos con JMP?
Tabla de datosGAMARe: detección de ARNiHola @thestrider
Con mucho gusto lo guiaré a través de este proceso.
Tengo algunas preguntas de aclaración / verificación ya que mi respuesta final dependerá de estas respuestas.
- Entonces, ¿su tabla de datos se parece a esto pero con muchos genes?
- ¿Hay solo un control por ejecución, pero tres mediciones técnicas de la misma condición dentro de la misma ejecución (como en la tabla anterior)?
- ¿Tiene algo como la condición x es una condición experimental, con tres réplicas técnicas para el gen x, y tiene muchas condiciones para el experimento (condición x, y, z, etc.)?
- Todos los detalles que pueda dar, la más precisa y apropiada será mi respuesta / solución.Incluso el aspecto de la salida de sus datos ayuda.
Gracias,
Re: detección de ARNi¡Hola Chris!
Tiene razón, mi conjunto de datos se ve casi exactamente como su imagen, con 400 genes (gen x, y, z, etc.) y algunos metadatos más que son solo para validar. (es decir, la ubicación de la microplaca de 96 pocillos, el nombre de la placa, etc.)
Cada ejecución tiene muchos controles, algunos son vectores vacíos (línea de base, sin efecto), otros son genes conocidos que generan respuestas altas o bajas. Cada microplaca tenía controles, y también probamos una microplaca de solo control en cada una de las tres corridas. Aproximadamente el 15% de mi conjunto de datos (~ 2000 de 15000 mediciones) son controles.
- ¿Tiene algo como la condición x es una condición experimental, con tres réplicas técnicas para el gen x, y tiene muchas condiciones para el experimento (condición x, y, z, etc.)
Creo que esta es una buena forma de describirlo. Cada gen de la lista es un gen desactivado. Entonces apagué 400 genes, uno a la vez. En cada ejecución tuve tres copias idénticas de cada microplaca, por lo que hay 3 réplicas técnicas de cada gen. Debo señalar aquí que, al azar, alrededor del 15% de los datos fueron censurados (las bacterias no crecieron, no se contaminaron, etc.), por lo que a veces los genes no tienen 3 réplicas técnicas. Luego repetí todo este experimento de la misma manera dos veces más. Entonces, en un mundo ideal, tengo 9 puntos de datos por condición. Sin embargo, la censura es aleatoria, por lo que algunos genes solo tienen 4-5 puntos de datos.
El promedio de control de vector vacío varía en los tres experimentos. Pero la respuesta de cada gen debería ser similar. Por lo tanto, un gen que reduce el valor de la línea de base siempre debe hacerlo, pero los números mismos varían a veces drásticamente en las tres ejecuciones.Por lo tanto, el gen X podría tener un valor de, por ejemplo, 70 frente a una línea de base promedio de 100 en una ejecución, pero un valor de 120 frente a una línea de base de 300 en la siguiente. Pensé que podría necesitar normalizarme, pero me preocupa que los datos puedan tener cola y no estoy seguro de las estadísticas para hacerlo. Estoy midiendo los niveles de fluorescencia, y básicamente las cosas tenues no se vuelven mucho más tenues, pero las cosas brillantes pueden volverse muy brillantes. Entonces, por cola me refiero en el ejemplo que acabo de dar, un gen brillante podría ser 350 vs 100 de referencia, pero en la siguiente ejecución podría ser 1200 vs 300 de referencia. En otras palabras, hay un gran rango numérico en el extremo superior de la escala, pero en el extremo inferior hay un rango más pequeño. Espero que tenga sentido.
Adjunto un pequeño powerpoint, muestra lo que estoy midiendo (c. Nematodos elegans) y una muestra de datos.
Re: detección de ARNiGracias @thestrider ,
Sí, hay varias cosas que deben abordarse aquí. No puedo decirle qué debe hacer estadísticamente (qué análisis necesitaría hacer o cómo abordar la variabilidad entre ejecuciones debido a factores externos, como el cambio de los valores de control y tratamiento), ya que se nos recomienda no brindar asesoramiento estadístico sobre cómo tratar cada uno de estos problemas, pero puedo indicarle qué plataformas dentro de JMP podrían ayudar a abordar algunos de ellos
No se pueden hacer comparaciones estadísticas dentro de la ejecución, ya que solo hay un control por ejecución y no hay forma de evaluar la variabilidad para la variación dentro de la ejecución para hacer esa comparación (al menos no mediante métodos estadísticos tradicionales que yo conozca).Se puede estimar la variación entre ejecuciones ya que hay tres controles, pero estará sesgada porque puede tener hasta 9 mediciones posibles para la condición de interés.Esto se consideraría desequilibrado y posiblemente le dé una variación desigual.Afortunadamente, JMP tiene un medio para lidiar con la varianza desigual en la plataforma Fit Y by X (respuesta del gen X en la sección Y, Response y condición en la sección X, Factor).Luego elija la prueba t del triángulo rojo que le dará las medias para cada grupo y un valor p para probar si la condición es diferente del control, asumiendo una varianza desigual. Los datos censurados son básicamente datos faltantes (no medibles debido a la razón dada) y tiene sentido por qué ha agregado réplicas técnicas para acomodar tales problemas en cada ejecución.
Además, como ha mencionado, los valores cambian de una ejecución a otra, incluido el control, casi como una situación de pares coincidentes (o una situación similar a una prueba t emparejada) o un efecto por lotes. Entonces, lo anterior por sí solo no es suficiente para ver si existe una diferencia estadística debido a este sesgo adicional. Podría haber muchas formas de abordar esto. Una puede ser hacer una regresión múltiple donde la ejecución y la condición son efectos (algo así como un lote y una condición que buscan efectos de lote y se adaptan a ellos).
En este caso, Fit Model es la plataforma a utilizar y elegir Mínimos Cuadrados Estándar como personalidad te llevará al tipo de prueba / análisis que podría ser más apropiado en tu caso. Primero probaría para ver si hay un efecto de ejecución poniendo ejecución, condición y la interacción de ejecución y condición como efectos del modelo y luego la respuesta del Gene X como Y.Podría hacer esto para todos los genes (y eso sería mucho para mirar para cientos de genes). Los pequeños datos de ejemplo que tiene, he hecho esto y definitivamente hay un efecto debido a la variabilidad de ejecución a ejecución, por lo que eso significa que debe tenerse en cuenta en las pruebas estadísticas que realiza.
Creé una tabla JMP y guardé los análisis de Fit Y by X y Fit Model en la tabla de datos para que pueda ver cómo realicé cada prueba. Se adjunta a esta publicación.
Es mejor ponerse en contacto con un estadístico interno o ver si uno de los amables miembros de nuestra comunidad está dispuesto a asesorarlo sobre la mejor manera de tratar su situación. Tal vez también tome lo gratis Pensamiento estadístico para la resolución de problemas industriales El curso podría ayudar a aprender más sobre estadísticas que podrían ayudar en esta situación.O echa un vistazo a Portal de conocimiento estadístico para una mayor mejora estadística.
Lo siento, no puedo dar el consejo estadístico que pueda necesitar, pero espero al menos haber señalado dónde en JMP podría ir para analizar sus datos y evaluar el experimento y probar la significancia de las condiciones.
Mejor,
Re: detección de ARNi
@Chris_Kirchberg escribió:
No se pueden realizar comparaciones estadísticas dentro de la ejecución, ya que solo hay un control por ejecución y no hay forma de evaluar la variabilidad de la variación dentro de la ejecución para hacer esa comparación
Hola Chris, muchas gracias por esto que es increíblemente útil. Estoy un poco confundido por esta parte, lo siento, no estaba claro, pero tengo ~ 210 puntos de datos de control de vectores vacíos para cada una de mis tres ejecuciones. Se distribuyen en todas las microplacas que hice (18 placas por ejecución), pero por lo demás son idénticas.También tengo un número similar de controles que utilizan respondedores altos y bajos conocidos.
Re: detección de ARNiHola @thestrider ,
Gracias por la aclaración. Pensé que solo tenías una medida de control por gen por ejecución.Esto tiene más sentido ahora.
¿Supongo que los 400 genes también están repartidos entre las 18 placas utilizadas en cada ejecución? ¿Se coloca cada réplica técnica de cada gen en una placa diferente? Eso significa 11 o 12 controles vacíos por placa y aproximadamente 22 genes individuales probados por placa. ¿Es eso correcto?
El enfoque para analizar esto depende del diseño del experimento y la ubicación de cada réplica técnica y los genes en las placas, así como de cómo se utilizarán los respondedores vacíos (simulados), bajos y altos. Cómo asignar las variables correctas a los campos correctos en JMP (como Ajustar modelo, Ajustar Y por Y, o incluso Detección de respuesta) dependerá de eso. Lo mismo para estructurar la tabla de datos.
Dado que los controles no son específicos de un gen, sino un conjunto de controles de vector vacíos / simulados, eso significa que la tabla de datos debe estar estructurada de manera que el mismo conjunto de controles tenga que ser referencia para cada gen. Además, habrá cierta normalización entre placas y también entre ejecuciones.
Tal vez alguien en la comunidad o en su organización pueda aconsejar cómo normalizar estos datos y cómo estructurarlos para que se pueda usar el Modelo de ajuste o la Evaluación de respuesta para sus datos. Esas son las dos plataformas que probablemente usaría para analizar los datos en este caso.
Lo siento, no pude guiarlo a los detalles más finos de cómo abordaría el análisis.
Mejor,
Re: detección de ARNiSolo desde una perspectiva de diseño experimental, me gustaría llegar a que la pregunta original era. Parece que está interesado en determinar cómo responde un gen en relación con un control. Pero tiene varios tipos de controles y no tengo claro cuál era el objetivo de cada control. Por ejemplo, podría restar el promedio de control negativo verdadero de toda la placa, para restar el fondo, luego podría normalizar los genes en la placa a un gen doméstico para determinar si la señal del gen estaba regulada hacia arriba o hacia abajo en relación con algo que se expresa constitutivamente. O tal vez normalizar a un gen que se expresa al máximo ...
El problema adicional aquí es que parece que cada una de las 18 placas tiene un rango dinámico tremendamente diferente. Y además de ese ruido, el rango dinámico en los experimentos repetidos también es considerable.
Un enfoque, y estoy seguro de que habrá críticas, es realizar una sustracción y normalización de fondo para cada placa, luego centrar y escalar la respuesta, o escalar la respuesta a 0-1. Esto obliga a que el rango dinámico de la placa sea idéntico para cada placa.
Ahora que hemos abordado ese problema, asumiendo que todavía hay algo que analizar, podríamos mirar los promedios de genes en las placas en cada réplica experimental, y luego tomar el promedio de los genes de las réplicas experimentales (sí, doble inmersión en los límites centrales teorema, y su legítimo.)
Parece que solo tiene 3 o 4 réplicas técnicas, por lo que estimar sigma es un poco incompleto con ese tamaño de muestra, pero podría mirar el% CV y establecer un umbral para determinar si los datos de cada gen son interpretables.
De acuerdo, todo este consejo se basa en no tener idea de cómo o qué hizo experimentalmente o incluso cómo se ven los datos reales, aunque sea vagamente. Entonces esto podría ser útil, o completamente inútil, pero con suerte lo primero.
-B
Re: detección de ARNi
@Chris_Kirchberg escribió:
Hola @thestrider ,
¿Supongo que los 400 genes también están repartidos entre las 18 placas utilizadas en cada ejecución? ¿Se coloca cada réplica técnica de cada gen en una placa diferente? Eso significa 11 o 12 controles vacíos por placa y aproximadamente 22 genes individuales probados por placa. ¿Es eso correcto?
El enfoque para analizar esto depende del diseño del experimento y la ubicación de cada réplica técnica y los genes en las placas, así como de cómo se utilizarán los respondedores vacíos (simulados), bajos y altos. Cómo asignar las variables correctas a los campos correctos en JMP (como Ajustar modelo, Ajustar Y por Y, o incluso Detección de respuesta) dependerá de eso. Lo mismo ocurre con la estructura de la tabla de datos.
Estás cerca, cada placa tiene 11-12 controles y ~ 80 genes repartidos en 5 microplacas diferentes. Una sexta microplaca son solo controles esparcidos por una placa. Se analizaron 3 copias de cada placa por ciclo, para un total de 18 placas. Por tanto, cada réplica técnica de cada gen se encuentra en 3 placas. Los controles de vector vacío son los más importantes, debían usarse para determinar la varianza en mis experimentos y establecer una tasa de respuesta de referencia.
La forma en que funciona el experimento: los animales se alimentan de una bacteria. En vector vacío, eso es todo. Pero cada gen representa un clon bacteriano que desactiva ese gen específico. Luego puedo medir la fluorescencia de un reportero para determinar cómo la desactivación de ese gen afecta una vía.
Los respondedores altos y bajos están ahí por dos razones: 1: para establecer que el experimento realmente está funcionando y 2: para tener una idea aproximada del nivel de respuesta que podemos esperar de mi ensayo. Los respondedores altos y bajos son los inhibidores y activadores primarios de la vía genética que estoy estudiando, al menos en lo que mi campo sabe actualmente. Se sospecha que los otros 400 genes tienen un efecto en esta vía en un experimento anterior.
Dado que los controles no son específicos de un gen, sino un grupo de controles de vector vacíos / simulados, eso significa que la tabla de datos debe estar estructurada de manera que el mismo grupo de controles tenga que ser referencia para cada gen. Además, habrá cierta normalización entre placas y también entre ejecuciones.
Correcto: los controles de vector vacíos son una referencia general para cada gen. Creo que la normalización entre carreras es muy necesaria. Entre placas también podría ser útil, pero la variación no es tan grande allí de lo que veo, al menos usando promedios aproximados. Si hay una manera de verificar esto rápidamente en jmp, me encantaría saber cómo hacerlo.
