RNA干扰筛选我有一个包含 3 个技术重复的 RNAi 数据集，一式三份。例如：
运行 1
基因 X 45
基因X 59
基因X 51
控制90
运行 2
基因 X 145
基因X 159
基因X 151
控制 190
运行 3
基因 X 35
基因 X 39
基因 X 31
控制 50
每个实验的真实数据集有数百个基因和数十个对照。 每次运行的平均值往往会有所不同，但实验是相同的。 我认为这是由于房间湿度造成的，但最终无关紧要。 我的兴趣在于基因，而不是跑步变异。 我基本上想看看哪些基因与对照不同，以及概率（p 值？）。 使用 JMP 分析这些数据的最佳方法是什么？
数据表美国能源部回复：RNAi 筛选你好@thestrider
我很乐意指导您完成此过程。
我有一些澄清/验证问题，因为我的最终回应将取决于这些答案。
- 那么你的数据表看起来像这样但有很多基因吗？
- 是否每次运行只有一个对照，但在同一运行中对相同条件进行了三个技术测量（如上表所示）？
- 您是否有类似条件 x 是一种实验条件，基因 x 具有三个技术重复，并且您有许多实验条件（条件 x、y、z 等）？
- 您可以提供尽可能多的详细信息，我的答案/解决方案将更加准确和适当。即使您的数据输出看起来也有帮助。
谢谢，
回复：RNAi 筛选嗨，克里斯！
你是对的，我的数据集看起来几乎和你的图片一模一样，有 400 个基因（基因 x、y、z 等）和一些仅用于验证的元数据。 （即 96 孔微孔板位置、板名称等）
每次运行都有许多对照，一些是空载体，（基线，无影响）其他是产生高或低响应的已知基因。 每个微孔板都有对照，我们还在三个运行中的每一个中测试了一个仅对照的微孔板。 我的数据集（大约 15000 个测量中的 2000 个）的大约 15% 是控件。
- 你有没有像条件 x 是一种实验条件，基因 x 有三个技术重复，并且你有很多实验条件（条件 x、y、z 等）？
我认为这是一个很好的描述方式。 列表中的每个基因都是一个被关闭的基因。 所以我关闭了 400 个基因，一次一个。 在每次运行中，每个微孔板都有三个相同的副本，因此每个基因有 3 个技术重复。 我应该在这里注意到随机删除了大约 15% 的数据（细菌没有生长、污染等），所以有时基因没有 3 次技术重复。 然后我以同样的方式重复了整个实验两次。 所以在一个理想的世界里，我每个条件有 9 个数据点。 审查是随机的，所以有些基因只有 4-5 个数据点。
空向量控制平均值在所有三个实验中都不同。 但是每个基因的反应应该是相似的。 因此，降低基线值的基因应该总是降低它，但在三个运行中，数字本身有时会发生很大变化。因此，基因 X 在一次运行中的值可能是 70 与 100 的平均基线，但在下一次运行中的值是 120 与基线 300。 我想我可能需要标准化，但我担心数据可能会拖尾，我不确定要这样做的统计数据。 我正在测量荧光水平，基本上昏暗的东西不会变得更暗，但明亮的东西会变得非常亮。 所以说tailed我的意思是在我刚刚给出的例子中，一个明亮的基因可能是350 vs 100基线，但在下一次运行中它可能是1200 vs 300基线。 换句话说，量表的高端有一个很大的数值范围，但低端有一个较小的范围。 我希望这是有道理的。
我附上了一个小幻灯片，它显示了我正在测量的内容（线虫线虫）和数据样本。
回复：RNAi 筛选谢谢@thestrider ,
是的，这里有很多事情需要解决。 我无法告诉您应该在统计上做什么（您需要进行哪些分析或如何解决由于外部因素（例如控制和治疗值的转移）造成的运行之间的差异），因为我们建议不要提供统计建议关于如何处理这些问题中的每一个，但我可以指出 JMP 中的哪些平台可以帮助解决其中的一些问题
无法进行运行内统计比较，因为每次运行只有一个对照，并且无法评估运行内变异的可变性以进行比较（至少不是通过我知道的传统统计方法）。由于存在三个对照，因此可以估计运行之间的变化，但它会产生偏差，因为您最多可以对感兴趣的条件进行 9 种可能的测量。这将被认为是不平衡的，并且可能会给您带来不等的方差。幸运的是，JMP 有一种方法可以处理 Fit Y by X 平台中的不等方差（Y 中的基因 X 响应，响应部分和 X 中的条件，因子部分）。然后从红色三角形中选择 t-Test，这将为您提供每个组的均值和一个 p 值，用于测试条件是否与控制不同，假设方差不等。 删失数据基本上是缺失的数据（由于给出的原因而无法测量），并且您添加技术重复以解决每次运行的此类问题的原因是有道理的。
此外，正如您所提到的，值从一次运行转移到另一次运行，包括控制，几乎就像匹配对情况（或配对 t 检验之类的情况）或批次效应。 因此，仅凭上述内容还不足以查看是否存在由于这种额外偏差而导致的统计差异。 可以有很多方法来解决这个问题。 一种可能是在运行和条件是效果的情况下进行多元回归（有点像批处理和条件寻找批处理效果并适应它们）。
在这种情况下，拟合模型是使用和选择标准最小二乘法的平台，因为个性将使您进入可能最适合您的情况的测试/分析类型。 我会首先通过将运行、条件以及运行和条件的相互作用作为模型效应，然后将基因 X 响应作为 Y 来测试是否存在运行效应。你可以对所有基因都这样做（对于数百个基因来说，这将是很多事情）。 您拥有的小示例数据，我已经这样做了，并且由于运行之间的可变性肯定会产生影响，因此这意味着必须在您执行的统计测试中考虑它。
我创建了一个 JMP 表，并将按 X 拟合 Y 和拟合模型分析保存到数据表中，这样您就可以看到我是如何执行每个测试的。 它附在这篇文章中。
最好联系内部的统计人员，或者看看我们的一位亲切的社区成员是否愿意就如何最好地处理您的情况提出建议。 也许也可以免费工业问题解决的统计思维课程可能有助于了解更多有关在这种情况下可能有所帮助的统计数据。或者看看统计知识门户以获得更多的统计技能提升。
抱歉，我无法提供您可能需要的统计建议，但我希望我至少指出了您可以在 JMP 中分析数据并评估实验和测试条件重要性的位置。
最好，
回复：RNAi 筛选
@Chris_Kirchberg写道：
无法进行运行内统计比较，因为每次运行只有一个对照，并且无法评估运行内变异的变异性以进行比较
嗨，克里斯，非常感谢这非常有帮助。 我对这部分有点困惑，抱歉我不清楚，但是我的三个运行中的每一个都有大约 210 个空向量控制数据点。 它们分布在我所做的每个微孔板上（每次运行 18 个板），但在其他方面是相同的。我还使用已知的高响应和低响应进行了类似数量的控制。
回复：RNAi 筛选你好@thestrider ,
感谢您的澄清。 我以为每次运行每个基因只有一个对照测量。这现在更有意义了。
我认为 400 个基因也分布在每次运行中使用的 18 个板中吗？ 每个基因的每个技术重复是否放在不同的平板上？ 所以这意味着每块板有 11 或 12 个空对照，每块板测试大约 22 个单独的基因。 那是对的吗？
分析这一点的方法取决于实验的设计和每个技术重复的放置和板上的基因，以及如何使用空（模拟）、低响应和高响应。 如何将正确的变量分配给 JMP 中的正确字段（例如拟合模型、按 Y 拟合 Y 或什至响应筛选）将取决于此。 如何构造数据表也是如此。
由于对照不是基因特异性的，而是一个空/模拟载体对照池，这意味着数据表的结构必须使得每个基因都必须参考相同的对照池。 此外，板之间和运行之间也会有一些标准化。
也许社区或您组织中的某个人可以建议如何规范化这些数据以及如何构建它，以便人们可以使用拟合模型或响应筛选来处理您的数据。 在这种情况下，我可能会使用这两个平台来分析数据。
抱歉，我无法引导您了解有关如何进行分析的更详细信息。
最好，
回复：RNAi 筛选仅从实验设计的角度来看，我想了解最初的问题是。 听起来您对确定基因相对于对照的反应感兴趣。 但是你有多种类型的控件，我不清楚每个控件的目标是什么。 例如，我可能会从整个平板中减去真正的阴性对照平均值，以减去背景，然后我可能会将平板上的基因标准化为看家基因，以确定基因的信号相对于某些东西是上调还是下调被构成性地表达。 或者可能标准化为最大表达的基因......
这里的另一个问题是，听起来 18 个板中的每一个都具有截然不同的动态范围。 除了噪音之外，重复实验的动态范围也相当可观。
一种方法，我敢肯定会有批评者，是对每个板进行背景减法和归一化，然后将响应居中并缩放，或将响应缩放到 0-1。这迫使每个板的板动态范围相同。
既然我们已经解决了这个问题，假设还有一些东西要分析，我们可以查看每个实验重复中板的基因平均值，然后从实验重复中取基因的平均值（是的，在中心极限上双浸定理，及其合法性。）
听起来您只有 3 或 4 个技术重复，因此估计 sigma 对那个样本量有点粗略，但我可能会查看 %CV，并设置一些阈值来确定每个基因的数据是否可解释。
诚然，所有这些建议都是基于不知道您在实验中是如何或做了什么，甚至不知道实际数据甚至模糊不清的样子。 所以这可能有帮助，或者完全没用，但希望是前者。
-B
回复：RNAi 筛选
@Chris_Kirchberg写道：
你好@thestrider ,
我认为 400 个基因也分布在每次运行中使用的 18 个板中吗？ 每个基因的每个技术重复是否放在不同的平板上？ 所以这意味着每块板有 11 或 12 个空对照，每块板测试大约 22 个单独的基因。 那是对的吗？
分析这一点的方法取决于实验的设计和每个技术重复的放置和板上的基因，以及如何使用空（模拟）、低响应和高响应。 如何将正确的变量分配给 JMP 中的正确字段（例如拟合模型、按 Y 拟合 Y，甚至响应筛选）将取决于此。 如何构造数据表也是如此。
你很接近，每个板有 11-12 个对照，大约 80 个基因分布在 5 个不同的微板中。 第六个微孔板只是分散在一个板上的对照。 每次运行分析每个板的 3 个副本，总共 18 个板。 因此，每个基因的每个技术重复都在 3 个板上。 空向量对照是最重要的，它们用于确定我的实验中的方差并建立基线响应率。
实验的工作方式——给动物喂食细菌。 在空向量中，就是这样。 但是每个基因都代表一个细菌克隆，可以关闭该特定基因。 然后我可以测量报告基因的荧光，以确定关闭该基因如何影响通路。
出现高反应者和低反应者有两个原因 - 1：确定实验确实有效；2：粗略了解我们可以从我的测定中预期的反应水平。 高和低反应者是我正在研究的基因途径的主要抑制剂和激活剂，至少就我的领域目前所知。 在先前的实验中，其他 400 个基因被怀疑对该途径有影响。
由于对照不是基因特异性的，而是一个空/模拟载体对照池，这意味着数据表的结构必须使得每个基因都必须参考相同的对照池。 此外，板之间和运行之间也会有一些标准化。
正确 - 空载体对照是每个基因的一般参考。 我认为运行之间的标准化是非常必要的。 板块之间也可能有帮助，但从我看到的情况来看，那里的差异并不大，至少使用粗略的平均值。 如果有办法在 jmp 中快速检查这个，我很想知道如何去做。
