RNAi 스크리닝저는 3회 반복 실험으로 얻은 RNAi 데이터 세트를 가지고 있습니다. 예를 들어,
1번째 실행
유전자 X 45
유전자 X 59
유전자 X 51
컨트롤 90
2번째 실행
유전자 X 145
유전자 X 159
유전자 X 151
제어 190
3번째 실행
유전자 X 35
유전자 X 39
유전자 X 31
컨트롤 50
실제 데이터 세트에는 실험당 수백 개의 유전자와 수십 개의 대조군이 있습니다. 각 실험마다 평균값이 달라지는 경향이 있지만, 실험 결과는 동일했습니다. 실내 습도 때문인 것 같지만, 결국에는 중요하지 않습니다. 제가 관심 있는 것은 실험 결과가 아니라 유전자입니다. 기본적으로 어떤 유전자가 대조군과 다른지, 그리고 확률(p값?)을 알고 싶습니다. JMP를 사용하여 이 데이터를 분석하는 가장 좋은 방법은 무엇일까요?
품질 및 공정 엔지니어링Re: RNAi 스크리닝안녕 @thestrider
이 과정을 안내해 드리겠습니다.
최종 답변이 이러한 답변에 따라 달라지기 때문에 몇 가지 설명/확인 질문이 있습니다.
- 그렇다면 데이터 테이블은 이와 비슷하지만 많은 유전자가 포함되어 있습니까?
- 실행당 하나의 컨트롤만 있지만 동일한 실행 내에서 동일한 조건에 대한 세 가지 기술 측정값이 있습니까(위의 표와 같이)?
- 조건 x가 하나의 실험 조건이고 유전자 x에 대한 세 가지 기술 복제가 있고 실험을 위한 많은 조건(조건 x, y, z 등)이 있습니까?
- 가능한 한 많은 세부 정보를 제공하면 더 정확하고 적절한 답변/해결책이 될 것입니다.데이터 출력이 어떻게 보이는지조차 도움이 됩니다.
감사,
Re: RNAi 스크리닝안녕 크리스!
맞습니다. 제 데이터 세트는 400개의 유전자(유전자 x, y, z 등)와 검증을 위한 추가 메타데이터를 포함하여 귀하의 사진과 거의 똑같습니다. (즉, 96웰 마이크로플레이트 위치, 플레이트 이름 등)
각 실행에는 많은 컨트롤이 있으며 일부는 빈 벡터이고(기준선, 효과 없음) 나머지는 높거나 낮은 반응을 생성하는 알려진 유전자입니다. 모든 마이크로플레이트에는 대조군이 있었고 우리는 세 번의 실행 각각에서 대조군 전용 마이크로플레이트도 테스트했습니다. 내 데이터 세트의 약 15%(15000개 측정 중 ~2000개)가 컨트롤입니다.
- 조건 x는 유전자 x에 대한 세 가지 기술 복제가 있는 하나의 실험 조건이고 실험에 대한 많은 조건(조건 x, y, z 등)이 있습니까?
나는 이것이 그것을 설명하는 좋은 방법이라고 생각합니다. 목록의 각 유전자는 꺼진 유전자입니다. 그래서 한 번에 하나씩 400개의 유전자를 차단했습니다. 각 실행에서 나는 각 마이크로플레이트의 3개의 동일한 사본을 가지고 있으므로 각 유전자의 3개의 기술 복제가 있습니다. 여기서 나는 무작위로 데이터의 약 15%가 검열되었다는 점에 주목해야 합니다(박테리아가 자라지 않았거나, 오염되지 않은 등). 그래서 때때로 유전자에는 3개의 기술적 복제가 없습니다. 그런 다음 이 전체 실험을 같은 방식으로 두 번 더 반복했습니다. 따라서 이상적인 세계에서는 조건당 9개의 데이터 포인트가 있습니다. 중도절단은 무작위이지만 일부 유전자에는 4-5개의 데이터 포인트만 있습니다.
빈 벡터 제어 평균은 세 가지 실험 모두에서 다양합니다. 그러나 각 유전자의 반응은 유사해야 합니다. 따라서 기준선에서 값을 낮추는 유전자는 항상 값을 낮추어야 하지만 숫자 자체는 세 번의 실행에서 때때로 크게 다릅니다.따라서 유전자 X는 한 번의 실행에서 100 평균 기준선에 대해 70의 값을 가질 수 있지만 다음 실행에서는 120 대 300의 값을 가질 수 있습니다. 정규화해야 할 필요가 있다고 생각했지만 데이터에 꼬리가 붙지 않을까 걱정이 되며 그렇게 하기 위한 통계가 불확실합니다. 저는 형광등 수준을 측정하고 있으며 기본적으로 어두운 것은 많이 어두워지지 않지만 밝은 것은 매우 밝아질 수 있습니다. 그래서 꼬리가 있다는 것은 내가 방금 준 예에서 밝은 유전자가 350 대 100 기준선이 될 수 있지만 다음 실행에서는 1200 대 300 기준선이 될 수 있음을 의미합니다. 즉, 스케일의 높은 쪽에는 큰 수치 범위가 있지만 낮은 쪽에는 더 작은 범위가 있습니다. 나는 그것이 의미가 있기를 바랍니다.
나는 약간의 파워포인트를 첨부했는데, 그것은 내가 측정하고 있는 것, ( c. elegans nematodes) 및 데이터 샘플링을 보여줍니다.
Re: RNAi 스크리닝감사 @thestrider ,
예, 여기에서 해결해야 할 여러 가지 사항이 있습니다. 통계적 조언을 제공하지 않는 것이 좋기 때문에 통계적으로 무엇을 해야 하는지 알려드릴 수 없습니다(어떤 분석을 수행해야 하는지 또는 통제 및 처리 값의 이동과 같은 외부 요인으로 인한 실행 간 변동성을 해결하는 방법). 이러한 각 문제를 처리하는 방법에 대해 설명하지만 JMP 내에서 이러한 문제 중 일부를 해결하는 데 도움이 될 수 있는 플랫폼을 알려드릴 수 있습니다.
실행 내 통계 비교는 실행당 하나의 컨트롤만 있고 해당 비교를 수행하기 위해 실행 내 변동에 대한 변동성을 평가할 방법이 없기 때문에 만들 수 없습니다(적어도 내가 알고 있는 전통적인 통계 방법으로는 불가능).3개의 컨트롤이 있으므로 실행 간의 변동을 추정할 수 있지만 관심 조건에 대해 최대 9개의 가능한 측정을 가질 수 있기 때문에 편향됩니다.이것은 불균형한 것으로 간주되어 불평등한 분산을 줄 수 있습니다.고맙게도 JMP에는 Fit Y by X 플랫폼의 불균등 분산을 처리하는 수단이 있습니다(Y의 유전자 X 반응, 반응 섹션의 조건 및 X, 요인 섹션의 조건).그런 다음 각 그룹에 대한 평균을 제공하는 빨간색 삼각형에서 t-검정을 선택하고 동일하지 않은 분산을 가정하여 조건이 통제와 다른 경우 검정을 위한 p-값을 제공합니다. 중도절단된 데이터는 기본적으로 누락된 데이터이며(주어진 이유 때문에 측정할 수 없음) 각 실행에 대해 이러한 문제를 수용하기 위해 기술 복제를 추가한 이유가 이해됩니다.
또한 언급했듯이 값은 대조를 포함하여 한 실행에서 다른 실행으로 이동합니다. 거의 일치 쌍 상황(또는 쌍 t-검정과 같은 상황) 또는 배치 효과와 같습니다. 따라서 위의 것만으로는 이러한 추가 편향으로 인해 통계적 차이가 있는지 확인하기에 충분하지 않습니다. 이 문제를 해결하는 방법은 여러 가지가 있을 수 있습니다. 하나는 실행과 조건이 효과인 다중 회귀를 수행하는 것일 수 있습니다(일괄 배치 및 조건이 배치 효과를 찾고 수용하는 것과 유사).
이 경우 맞춤 모델은 사용자의 경우에 가장 적합한 테스트/분석 유형을 제공하는 특성으로 표준 최소 제곱을 사용하고 선택하는 플랫폼입니다. 먼저 run, condition 및 run과 condition의 상호 작용을 모델 효과로 넣은 다음 Gene X 응답을 Y로 넣어 실행 효과가 있는지 테스트합니다.모든 유전자에 대해 이 작업을 수행할 수 있습니다(수백 개의 유전자를 살펴보는 데 많은 시간이 소요될 것입니다). 당신이 가지고 있는 작은 예제 데이터, 나는 이것을 했고 실행 간 변동성으로 인한 영향이 분명히 있으므로 수행하는 통계 테스트에서 설명되어야 함을 의미합니다.
JMP 테이블을 생성하고 Fit Y by X 및 Fit Model 분석을 데이터 테이블에 저장하여 각 테스트를 수행한 방법을 볼 수 있습니다. 이 게시물에 첨부되어 있습니다.
집에 있는 통계 전문가에게 연락하거나 은혜로운 커뮤니티 구성원 중 한 명이 귀하의 상황을 가장 잘 처리할 수 있는 방법에 대해 기꺼이 조언해 줄 수 있는지 확인하는 것이 가장 좋습니다. 어쩌면 또한 무료로 산업 문제 해결을 위한 통계적 사고 과정은 이 상황에서 도움이 될 수 있는 통계에 대해 더 많이 배우는 데 도움이 될 수 있습니다.아니면 좀 봐 통계 지식 포털 더 많은 통계적 향상을 위해.
죄송합니다. 필요한 통계적 조언을 드릴 수는 없지만 최소한 JMP에서 데이터를 분석하고 실험을 평가하고 조건의 중요성을 테스트할 수 있는 곳을 지적했으면 합니다.
최상의,
Re: RNAi 스크리닝
@Chris_Kirchberg 썼다:
실행 내 통계 비교는 실행당 하나의 컨트롤만 있고 해당 비교를 수행하기 위해 실행 내 변동에 대한 변동성을 평가할 방법이 없기 때문에 수행할 수 없습니다.
안녕 Chris, 믿을 수 없을 정도로 도움이 되는 이것에 대해 대단히 감사합니다. 이 부분이 약간 혼란스럽습니다. 명확하지 않아서 죄송합니다. 하지만 세 번의 실행 각각에 대해 ~210개의 빈 벡터 제어 데이터 포인트가 있습니다. 그것들은 내가 한 모든 마이크로플레이트(실행당 18개 플레이트)에 걸쳐 있지만 그 외에는 동일합니다.나는 또한 알려진 높고 낮은 응답자를 사용하여 비슷한 수의 컨트롤을 가지고 있습니다.
Re: RNAi 스크리닝안녕 @thestrider ,
설명해주셔서 감사합니다. 실행당 유전자당 하나의 대조군 측정만 있다고 생각했습니다.이것은 이제 더 의미가 있습니다.
각 실행에 사용된 18개의 플레이트에도 400개의 유전자가 퍼져 있다고 생각하십니까? 각 유전자에 대한 각 기술 복제물이 다른 플레이트에 배치됩니까? 따라서 플레이트당 11개 또는 12개의 빈 대조군과 플레이트당 약 22개의 개별 유전자가 테스트됩니다. 그 맞습니까?
이를 분석하는 접근 방식은 실험 설계와 플레이트 전체에 걸친 각 기술적 복제 및 유전자의 배치, 그리고 빈(모의), 낮은 및 높은 응답자가 사용되는 방법에 따라 다릅니다. JMP의 올바른 필드에 올바른 변수를 할당하는 방법(예: Fit Model, Fit Y by Y 또는 Response Screening)은 이에 따라 다릅니다. 데이터 테이블을 구성하는 방법과 동일합니다.
컨트롤은 유전자 특이적이 아니라 빈/모의 벡터 컨트롤의 풀이기 때문에 데이터 테이블은 동일한 컨트롤 풀이 각 유전자에 대해 참조되어야 하도록 구조화되어야 함을 의미합니다. 또한 플레이트 사이와 실행 사이에도 약간의 정규화가 있을 것입니다.
커뮤니티나 조직의 누군가가 이 데이터를 정규화하는 방법과 데이터에 적합한 모델 또는 반응 선별을 사용할 수 있도록 구조화하는 방법을 조언할 수 있습니다. 이 두 가지 플랫폼이 이 경우 데이터를 분석하는 데 사용할 수 있습니다.
분석에 접근하는 방법에 대한 자세한 내용을 안내해 드리지 못해 죄송합니다.
최상의,
Re: RNAi 스크리닝실험적인 디자인의 관점에서 저는 원래의 질문이 무엇인지 알고 싶습니다. 유전자가 대조군에 대해 어떻게 반응하는지 결정하는 데 관심이 있는 것처럼 들립니다. 그러나 여러 유형의 컨트롤이 있으며 각 컨트롤의 목표가 무엇인지 확실하지 않습니다. 예를 들어, 전체 플레이트에서 진정한 음성 대조군 평균을 빼서 배경을 뺀 다음, 플레이트의 유전자를 하우스 키핑 유전자로 정규화하여 유전자의 신호가 어떤 것에 비해 상향 조절되었는지 하향 조절되었는지 결정할 수 있습니다. 구성적으로 표현된다. 아니면 최대로 발현되는 유전자로 정상화할 수도...
여기서 추가 문제는 18개의 플레이트 각각이 매우 다른 다이내믹 레인지를 갖는 것처럼 들린다는 것입니다. 그리고 그 노이즈 외에도 반복되는 실험에서 동적 범위도 상당합니다.
한 가지 접근 방식은 비평가가 있을 것이라고 확신합니다. 각 플레이트에 대해 배경 빼기 및 정규화를 수행한 다음 응답을 중앙에 놓고 스케일링하거나 응답을 0-1로 스케일링합니다. 이렇게 하면 플레이트 동적 범위가 각 플레이트에 대해 동일하게 됩니다.
이제 그 문제를 해결했으므로 아직 분석할 것이 있다고 가정하고 각 실험 복제에서 플레이트 전체의 유전자 평균을 확인한 다음 실험 복제에서 유전자의 평균을 취할 수 있습니다(예, 중앙 한계에 이중 침지 정리와 그 합법성.)
기술 복제가 3개 또는 4개뿐인 것처럼 들리므로 해당 샘플 크기로 시그마를 추정하는 것이 약간 스케치되지만 %CV를 보고 각 유전자에 대한 데이터가 해석 가능한지 결정하기 위한 임계값을 설정할 수 있습니다.
이 모든 조언은 실험적으로 어떻게 또는 무엇을 했는지 또는 실제 데이터가 막연하게 보이는지조차 모르는 데 기초한 것입니다. 따라서 이것은 도움이 될 수도 있고 완전히 쓸모가 없을 수도 있지만 바라건대 전자입니다.
-NS
Re: RNAi 스크리닝
@Chris_Kirchberg 썼다:
안녕 @thestrider ,
각 실행에 사용된 18개의 플레이트에도 400개의 유전자가 퍼져 있다고 생각하십니까? 각 유전자에 대한 각 기술 복제물이 다른 플레이트에 배치됩니까? 따라서 플레이트당 11개 또는 12개의 빈 대조군과 플레이트당 약 22개의 개별 유전자가 테스트됩니다. 그 맞습니까?
이를 분석하는 접근 방식은 실험 설계와 플레이트 전체에 걸친 각 기술적 복제 및 유전자의 배치, 그리고 빈(모의), 낮은 및 높은 응답자가 사용되는 방법에 따라 다릅니다. JMP의 올바른 필드에 올바른 변수를 할당하는 방법(예: Fit Model, Fit Y by Y 또는 Response Screening)은 이에 따라 다릅니다. 데이터 테이블을 구성하는 방법과 동일합니다.
가깝습니다. 각 플레이트에는 11-12개의 컨트롤이 있고 ~80개의 유전자가 5개의 서로 다른 마이크로플레이트에 퍼져 있습니다. 여섯 번째 마이크로플레이트는 플레이트 전체에 흩어져 있는 컨트롤입니다. 총 18개의 플레이트에 대해 각 플레이트의 3개 사본을 실행당 분석했습니다. 따라서 각 유전자에 대한 각 기술 복제는 3개의 플레이트에 있습니다. 빈 벡터 컨트롤이 가장 중요하며 내 실험의 분산을 결정하고 기준 응답률을 설정하는 데 사용되었습니다.
실험이 작동하는 방식 - 동물에게 박테리아를 먹입니다. 빈 벡터에서, 그게 다야. 그러나 각 유전자는 특정 유전자를 끄는 박테리아 클론을 나타냅니다. 그런 다음 리포터의 형광을 측정하여 해당 유전자를 끄는 것이 경로에 어떤 영향을 미치는지 결정할 수 있습니다.
높은 반응자와 낮은 반응자는 두 가지 이유 때문에 존재합니다. 1: 실험이 실제로 작동하는지 확인하기 위함이고 2: 내 분석에서 기대할 수 있는 반응 수준에 대한 대략적인 아이디어를 얻기 위함입니다. 적어도 내 분야가 현재 알고 있는 한, 높거나 낮은 반응자는 내가 연구하고 있는 유전자 경로의 주요 억제제이자 활성화제입니다. 다른 400개의 유전자는 이전 실험에서 이 경로에 영향을 미치는 것으로 의심됩니다.
컨트롤은 유전자 특이적이 아니라 빈/모의 벡터 컨트롤 풀이기 때문에 데이터 테이블은 동일한 컨트롤 풀이 각 유전자에 대해 참조되어야 하도록 구조화되어야 함을 의미합니다. 또한 플레이트 사이와 실행 사이에도 약간의 정규화가 있을 것입니다.
정답- 빈 벡터 컨트롤은 각 유전자에 대한 일반적인 참조입니다. 나는 실행 사이의 정규화가 매우 필요하다고 생각합니다. 판 사이도 도움이 될 수 있지만 적어도 대략적인 평균을 사용하면 내가 보는 것과 차이가 크지 않습니다. jmp에서 이를 빠르게 확인할 수 있는 방법이 있다면 그 방법을 알고 싶습니다.
Re: RNAi 스크리닝먼저, 많은 답변을 주셔서 정말 감사합니다. 이 커뮤니티에서 받는 많은 도움에 정말 감동했습니다. 정말 놀랍습니다.
@Byron_JMP 님 이 다음과 같이 썼습니다:
실험 설계 관점에서, 원래 질문이 무엇이었는지 말씀드리고 싶습니다. 유전자가 대조군에 비해 어떻게 반응하는지 확인하는 데 관심이 있는 것 같습니다. 하지만 여러 유형의 대조군이 있고, 각 대조군의 목표가 무엇인지 잘 모르겠습니다. 예를 들어, 전체 플레이트에서 진정한 음성 대조군 평균을 빼서 배경을 뺀 다음, 플레이트의 유전자를 하우스키핑 유전자로 정규화하여 유전자 신호가 구성적으로 발현되는 것에 비해 상향 또는 하향 조절되었는지 확인할 수 있습니다. 아니면 최대로 발현되는 유전자로 정규화할 수도 있습니다...
목표는 형광 리포터를 사용하여 경로에 영향을 미치는 유전자를 발견하는 것이었습니다. 빈 벡터는 제 기준선이며, 아무것도 하지 않을 때 무슨 일이 일어나는지 보여줍니다. 따라서 하우스키핑 유전자를 사용하는 것과 대략 유사합니다. 양성 및 음성은 제 RNA 간섭이 작동하는지(특정 유전자의 노크다운을 유도) 확인하고 분석에서 형광 범위에 대한 대략적인 아이디어를 얻기 위해 있습니다. JMP를 사용하여 빈 벡터에 대한 정규화를 어떻게 수행할까요? 이것은 또한 도움이 될 것이라고 생각한 것이고, 여러분이 비슷하게 생각하신다는 것을 듣고 기쁩니다.
여기서 추가적인 문제는 18개 판 각각이 매우 다른 동적 범위를 가지고 있는 것처럼 들린다는 것입니다. 그리고 그 노이즈 외에도 반복된 실험에 걸친 동적 범위도 상당합니다.
참고- 한 번의 실험에서 18개의 플레이트는 크게 다른 동적 범위를 갖지 않습니다. 플레이트 간에는 합리적인 것으로 보이며, 플레이트 위치에 따른 차이도 크게 보이지 않습니다. 실험을 두 번 반복했을 때(54개의 플레이트 데이터가 있음) 동적 범위의 급격한 변화가 실제로 보입니다. 반복 실험은 동일해야 했지만 습도가 높은 날이었던 것 같습니다. 제 리포터는 산소에 민감합니다...
한 가지 접근 방식은 각 판에 대해 배경 빼기와 정규화를 수행하는 것입니다. 그런 다음 응답을 중앙에 놓고 크기를 조정하거나 응답을 0-1로 조정합니다. 이렇게 하면 각 판에 대해 판의 동적 범위가 동일해집니다.
이제 문제를 해결했으니, 아직 분석할 것이 있다고 가정하고, 각 실험 반복에서 플레이트 전체의 유전자 평균을 살펴본 다음, 실험 반복에서 유전자의 평균을 구할 수 있습니다(중심 극한 정리를 두 번 사용한 셈이고, 적법한 방법입니다.)
흥미로울 것 같은데요, jmp에서는 어떻게 해야 할까요?
기술적 반복 실험이 3~4개밖에 없는 것 같아서 그 표본 크기로는 시그마를 추정하는 게 약간 모호할 수도 있지만, %CV를 살펴보고 각 유전자에 대한 데이터를 해석할 수 있는지 판별하기 위한 임계값을 설정할 수도 있을 것 같습니다.
저는 최대 9개의 데이터 포인트를 가지고 있는데, 3개의 동일한 실험일의 3개의 마이크로플레이트(기술적 반복)에서 각각 1개의 포인트입니다(생물학적 반복). 이런 유형의 스크린의 경우, 제 분야에는 반복이 없는 논문이 발표되어 있습니다. 저는 최소한 몇 개의 반복을 생성함으로써 제 데이터 세트에서 약한 반응을 보이는 사람을 잡을 수 있기를 바랐습니다. jmp에서 임계값을 어떻게 설정할 수 있습니까?
고맙습니다. 정말 도움이 됩니다!
Re: RNAi 스크리닝안녕하세요 @더스트라이더 ,
JMP에서 사용해야 할 도구는 아마도 열 수식(분석할 정규화된 데이터를 생성하는 데 사용)과 적합 모형(반응 변수와 모델 효과, 확률 변수, 상호작용 등을 정의하는 표준 최소 제곱 모형)일 것입니다. 데이터 정규화를 위한 수식을 어떻게 생성할지, 그리고 실험에 어떤 모델 효과가 필요한지는 통계학 지식과 실험 설계에 대한 지식에 따라 달라집니다.
이 커뮤니티 사이트에서 96웰 플레이트 데이터 분석 및 96웰 플레이트 형식에 따른 실험 설계 관련 검색 링크 가 있습니다. 살펴보시면 해당 형식을 기반으로 데이터 유형을 분석하는 방법에 대한 지침을 얻으실 수 있을 것입니다.
또한, 표준 최소 제곱법을 사용하여 열 수식 과 적합 모델을 만드는 방법에 대한 JMP 설명서에 대한 링크도 있습니다.
JMP에서 이러한 작업을 수행하는 위치를 파악하는 데 도움이 되기를 바랍니다.
건배,
