RNAi 스크리닝3중으로 수행된 3개의 기술 복제가 포함된 RNAi 데이터 세트가 있습니다.예를 들어:
실행 1
유전자 X 45
유전자 X 59
유전자 X 51
컨트롤 90
실행 2
유전자 X 145
유전자 X 159
유전자 X 151
컨트롤 190
3번 실행
유전자 X 35
유전자 X 39
유전자 X 31
컨트롤 50
실제 데이터 세트에는 실험당 수백 개의 유전자와 수십 개의 컨트롤이 있습니다. 각 실행은 평균이 다른 경향이 있지만 실험은 동일했습니다. 나는 이것이 실내 습도 때문이라고 생각하지만 결국 그것은 중요하지 않습니다. 내 관심은 실행 변이가 아니라 유전자에 있습니다. 기본적으로 어떤 유전자가 대조군과 다른지, 확률(p값?)을 알고 싶습니다. JMP로 이 데이터를 분석하는 가장 좋은 방법은 무엇입니까?
데이터 테이블암사슴Re: RNAi 스크리닝안녕 @thestrider
이 과정을 안내해 드리겠습니다.
최종 답변이 이러한 답변에 따라 달라지기 때문에 몇 가지 설명/확인 질문이 있습니다.
- 그렇다면 데이터 테이블은 이와 비슷하지만 많은 유전자가 포함되어 있습니까?
- 실행당 하나의 컨트롤만 있지만 동일한 실행 내에서 동일한 조건에 대한 세 가지 기술 측정값이 있습니까(위의 표와 같이)?
- 조건 x가 하나의 실험 조건이고 유전자 x에 대한 세 가지 기술 복제가 있고 실험을 위한 많은 조건(조건 x, y, z 등)이 있습니까?
- 가능한 한 많은 세부 정보를 제공하면 더 정확하고 적절한 답변/해결책이 될 것입니다.데이터 출력이 어떻게 보이는지조차 도움이 됩니다.
감사,
Re: RNAi 스크리닝안녕 크리스!
맞습니다. 제 데이터 세트는 400개의 유전자(유전자 x, y, z 등)와 검증을 위한 추가 메타데이터를 포함하여 귀하의 사진과 거의 똑같습니다. (즉, 96웰 마이크로플레이트 위치, 플레이트 이름 등)
각 실행에는 많은 컨트롤이 있으며 일부는 빈 벡터이고(기준선, 효과 없음) 나머지는 높거나 낮은 반응을 생성하는 알려진 유전자입니다. 모든 마이크로플레이트에는 대조군이 있었고 우리는 세 번의 실행 각각에서 대조군 전용 마이크로플레이트도 테스트했습니다. 내 데이터 세트의 약 15%(15000개 측정 중 ~2000개)가 컨트롤입니다.
- 조건 x는 유전자 x에 대한 세 가지 기술 복제가 있는 하나의 실험 조건이고 실험에 대한 많은 조건(조건 x, y, z 등)이 있습니까?
나는 이것이 그것을 설명하는 좋은 방법이라고 생각합니다. 목록의 각 유전자는 꺼진 유전자입니다. 그래서 한 번에 하나씩 400개의 유전자를 차단했습니다. 각 실행에서 나는 각 마이크로플레이트의 3개의 동일한 사본을 가지고 있으므로 각 유전자의 3개의 기술 복제가 있습니다. 여기서 나는 무작위로 데이터의 약 15%가 검열되었다는 점에 주목해야 합니다(박테리아가 자라지 않았거나, 오염되지 않은 등). 그래서 때때로 유전자에는 3개의 기술적 복제가 없습니다. 그런 다음 이 전체 실험을 같은 방식으로 두 번 더 반복했습니다. 따라서 이상적인 세계에서는 조건당 9개의 데이터 포인트가 있습니다. 중도절단은 무작위이지만 일부 유전자에는 4-5개의 데이터 포인트만 있습니다.
빈 벡터 제어 평균은 세 가지 실험 모두에서 다양합니다. 그러나 각 유전자의 반응은 유사해야 합니다. 따라서 기준선에서 값을 낮추는 유전자는 항상 값을 낮추어야 하지만 숫자 자체는 세 번의 실행에서 때때로 크게 다릅니다.따라서 유전자 X는 한 번의 실행에서 100 평균 기준선에 대해 70의 값을 가질 수 있지만 다음 실행에서는 120 대 300의 값을 가질 수 있습니다. 정규화해야 할 필요가 있다고 생각했지만 데이터에 꼬리가 붙지 않을까 걱정이 되며 그렇게 하기 위한 통계가 불확실합니다. 저는 형광등 수준을 측정하고 있으며 기본적으로 어두운 것은 많이 어두워지지 않지만 밝은 것은 매우 밝아질 수 있습니다. 그래서 꼬리가 있다는 것은 내가 방금 준 예에서 밝은 유전자가 350 대 100 기준선이 될 수 있지만 다음 실행에서는 1200 대 300 기준선이 될 수 있음을 의미합니다. 즉, 스케일의 높은 쪽에는 큰 수치 범위가 있지만 낮은 쪽에는 더 작은 범위가 있습니다. 나는 그것이 의미가 있기를 바랍니다.
나는 약간의 파워포인트를 첨부했는데, 그것은 내가 측정하고 있는 것, ( c. elegans nematodes) 및 데이터 샘플링을 보여줍니다.
Re: RNAi 스크리닝감사 @thestrider ,
예, 여기에서 해결해야 할 여러 가지 사항이 있습니다. 통계적 조언을 제공하지 않는 것이 좋기 때문에 통계적으로 무엇을 해야 하는지 알려드릴 수 없습니다(어떤 분석을 수행해야 하는지 또는 통제 및 처리 값의 이동과 같은 외부 요인으로 인한 실행 간 변동성을 해결하는 방법). 이러한 각 문제를 처리하는 방법에 대해 설명하지만 JMP 내에서 이러한 문제 중 일부를 해결하는 데 도움이 될 수 있는 플랫폼을 알려드릴 수 있습니다.
실행 내 통계 비교는 실행당 하나의 컨트롤만 있고 해당 비교를 수행하기 위해 실행 내 변동에 대한 변동성을 평가할 방법이 없기 때문에 만들 수 없습니다(적어도 내가 알고 있는 전통적인 통계 방법으로는 불가능).3개의 컨트롤이 있으므로 실행 간의 변동을 추정할 수 있지만 관심 조건에 대해 최대 9개의 가능한 측정을 가질 수 있기 때문에 편향됩니다.이것은 불균형한 것으로 간주되어 불평등한 분산을 줄 수 있습니다.고맙게도 JMP에는 Fit Y by X 플랫폼의 불균등 분산을 처리하는 수단이 있습니다(Y의 유전자 X 반응, 반응 섹션의 조건 및 X, 요인 섹션의 조건).그런 다음 각 그룹에 대한 평균을 제공하는 빨간색 삼각형에서 t-검정을 선택하고 동일하지 않은 분산을 가정하여 조건이 통제와 다른 경우 검정을 위한 p-값을 제공합니다. 중도절단된 데이터는 기본적으로 누락된 데이터이며(주어진 이유 때문에 측정할 수 없음) 각 실행에 대해 이러한 문제를 수용하기 위해 기술 복제를 추가한 이유가 이해됩니다.
또한 언급했듯이 값은 대조를 포함하여 한 실행에서 다른 실행으로 이동합니다. 거의 일치 쌍 상황(또는 쌍 t-검정과 같은 상황) 또는 배치 효과와 같습니다. 따라서 위의 것만으로는 이러한 추가 편향으로 인해 통계적 차이가 있는지 확인하기에 충분하지 않습니다. 이 문제를 해결하는 방법은 여러 가지가 있을 수 있습니다. 하나는 실행과 조건이 효과인 다중 회귀를 수행하는 것일 수 있습니다(일괄 배치 및 조건이 배치 효과를 찾고 수용하는 것과 유사).
이 경우 맞춤 모델은 사용자의 경우에 가장 적합한 테스트/분석 유형을 제공하는 특성으로 표준 최소 제곱을 사용하고 선택하는 플랫폼입니다. 먼저 run, condition 및 run과 condition의 상호 작용을 모델 효과로 넣은 다음 Gene X 응답을 Y로 넣어 실행 효과가 있는지 테스트합니다.모든 유전자에 대해 이 작업을 수행할 수 있습니다(수백 개의 유전자를 살펴보는 데 많은 시간이 소요될 것입니다). 당신이 가지고 있는 작은 예제 데이터, 나는 이것을 했고 실행 간 변동성으로 인한 영향이 분명히 있으므로 수행하는 통계 테스트에서 설명되어야 함을 의미합니다.
JMP 테이블을 생성하고 Fit Y by X 및 Fit Model 분석을 데이터 테이블에 저장하여 각 테스트를 수행한 방법을 볼 수 있습니다. 이 게시물에 첨부되어 있습니다.
집에 있는 통계 전문가에게 연락하거나 은혜로운 커뮤니티 구성원 중 한 명이 귀하의 상황을 가장 잘 처리할 수 있는 방법에 대해 기꺼이 조언해 줄 수 있는지 확인하는 것이 가장 좋습니다. 어쩌면 또한 무료로 산업 문제 해결을 위한 통계적 사고 과정은 이 상황에서 도움이 될 수 있는 통계에 대해 더 많이 배우는 데 도움이 될 수 있습니다.아니면 좀 봐 통계 지식 포털 더 많은 통계적 향상을 위해.
죄송합니다. 필요한 통계적 조언을 드릴 수는 없지만 최소한 JMP에서 데이터를 분석하고 실험을 평가하고 조건의 중요성을 테스트할 수 있는 곳을 지적했으면 합니다.
최상의,
Re: RNAi 스크리닝
@Chris_Kirchberg 썼다:
실행 내 통계 비교는 실행당 하나의 컨트롤만 있고 해당 비교를 수행하기 위해 실행 내 변동에 대한 변동성을 평가할 방법이 없기 때문에 수행할 수 없습니다.
안녕 Chris, 믿을 수 없을 정도로 도움이 되는 이것에 대해 대단히 감사합니다. 이 부분이 약간 혼란스럽습니다. 명확하지 않아서 죄송합니다. 하지만 세 번의 실행 각각에 대해 ~210개의 빈 벡터 제어 데이터 포인트가 있습니다. 그것들은 내가 한 모든 마이크로플레이트(실행당 18개 플레이트)에 걸쳐 있지만 그 외에는 동일합니다.나는 또한 알려진 높고 낮은 응답자를 사용하여 비슷한 수의 컨트롤을 가지고 있습니다.
Re: RNAi 스크리닝안녕 @thestrider ,
설명해주셔서 감사합니다. 실행당 유전자당 하나의 대조군 측정만 있다고 생각했습니다.이것은 이제 더 의미가 있습니다.
각 실행에 사용된 18개의 플레이트에도 400개의 유전자가 퍼져 있다고 생각하십니까? 각 유전자에 대한 각 기술 복제물이 다른 플레이트에 배치됩니까? 따라서 플레이트당 11개 또는 12개의 빈 대조군과 플레이트당 약 22개의 개별 유전자가 테스트됩니다. 그 맞습니까?
이를 분석하는 접근 방식은 실험 설계와 플레이트 전체에 걸친 각 기술적 복제 및 유전자의 배치, 그리고 빈(모의), 낮은 및 높은 응답자가 사용되는 방법에 따라 다릅니다. JMP의 올바른 필드에 올바른 변수를 할당하는 방법(예: Fit Model, Fit Y by Y 또는 Response Screening)은 이에 따라 다릅니다. 데이터 테이블을 구성하는 방법과 동일합니다.
컨트롤은 유전자 특이적이 아니라 빈/모의 벡터 컨트롤의 풀이기 때문에 데이터 테이블은 동일한 컨트롤 풀이 각 유전자에 대해 참조되어야 하도록 구조화되어야 함을 의미합니다. 또한 플레이트 사이와 실행 사이에도 약간의 정규화가 있을 것입니다.
커뮤니티나 조직의 누군가가 이 데이터를 정규화하는 방법과 데이터에 적합한 모델 또는 반응 선별을 사용할 수 있도록 구조화하는 방법을 조언할 수 있습니다. 이 두 가지 플랫폼이 이 경우 데이터를 분석하는 데 사용할 수 있습니다.
분석에 접근하는 방법에 대한 자세한 내용을 안내해 드리지 못해 죄송합니다.
최상의,
Re: RNAi 스크리닝실험적인 디자인의 관점에서 저는 원래의 질문이 무엇인지 알고 싶습니다. 유전자가 대조군에 대해 어떻게 반응하는지 결정하는 데 관심이 있는 것처럼 들립니다. 그러나 여러 유형의 컨트롤이 있으며 각 컨트롤의 목표가 무엇인지 확실하지 않습니다. 예를 들어, 전체 플레이트에서 진정한 음성 대조군 평균을 빼서 배경을 뺀 다음, 플레이트의 유전자를 하우스 키핑 유전자로 정규화하여 유전자의 신호가 어떤 것에 비해 상향 조절되었는지 하향 조절되었는지 결정할 수 있습니다. 구성적으로 표현된다. 아니면 최대로 발현되는 유전자로 정상화할 수도...
여기서 추가 문제는 18개의 플레이트 각각이 매우 다른 다이내믹 레인지를 갖는 것처럼 들린다는 것입니다. 그리고 그 노이즈 외에도 반복되는 실험에서 동적 범위도 상당합니다.
한 가지 접근 방식은 비평가가 있을 것이라고 확신합니다. 각 플레이트에 대해 배경 빼기 및 정규화를 수행한 다음 응답을 중앙에 놓고 스케일링하거나 응답을 0-1로 스케일링합니다. 이렇게 하면 플레이트 동적 범위가 각 플레이트에 대해 동일하게 됩니다.
이제 그 문제를 해결했으므로 아직 분석할 것이 있다고 가정하고 각 실험 복제에서 플레이트 전체의 유전자 평균을 확인한 다음 실험 복제에서 유전자의 평균을 취할 수 있습니다(예, 중앙 한계에 이중 침지 정리와 그 합법성.)
기술 복제가 3개 또는 4개뿐인 것처럼 들리므로 해당 샘플 크기로 시그마를 추정하는 것이 약간 스케치되지만 %CV를 보고 각 유전자에 대한 데이터가 해석 가능한지 결정하기 위한 임계값을 설정할 수 있습니다.
이 모든 조언은 실험적으로 어떻게 또는 무엇을 했는지 또는 실제 데이터가 막연하게 보이는지조차 모르는 데 기초한 것입니다. 따라서 이것은 도움이 될 수도 있고 완전히 쓸모가 없을 수도 있지만 바라건대 전자입니다.
-NS
Re: RNAi 스크리닝
@Chris_Kirchberg 썼다:
안녕 @thestrider ,
각 실행에 사용된 18개의 플레이트에도 400개의 유전자가 퍼져 있다고 생각하십니까? 각 유전자에 대한 각 기술 복제물이 다른 플레이트에 배치됩니까? 따라서 플레이트당 11개 또는 12개의 빈 대조군과 플레이트당 약 22개의 개별 유전자가 테스트됩니다. 그 맞습니까?
이를 분석하는 접근 방식은 실험 설계와 플레이트 전체에 걸친 각 기술적 복제 및 유전자의 배치, 그리고 빈(모의), 낮은 및 높은 응답자가 사용되는 방법에 따라 다릅니다. JMP의 올바른 필드에 올바른 변수를 할당하는 방법(예: Fit Model, Fit Y by Y 또는 Response Screening)은 이에 따라 다릅니다. 데이터 테이블을 구성하는 방법과 동일합니다.
가깝습니다. 각 플레이트에는 11-12개의 컨트롤이 있고 ~80개의 유전자가 5개의 서로 다른 마이크로플레이트에 퍼져 있습니다. 여섯 번째 마이크로플레이트는 플레이트 전체에 흩어져 있는 컨트롤입니다. 총 18개의 플레이트에 대해 각 플레이트의 3개 사본을 실행당 분석했습니다. 따라서 각 유전자에 대한 각 기술 복제는 3개의 플레이트에 있습니다. 빈 벡터 컨트롤이 가장 중요하며 내 실험의 분산을 결정하고 기준 응답률을 설정하는 데 사용되었습니다.
실험이 작동하는 방식 - 동물에게 박테리아를 먹입니다. 빈 벡터에서, 그게 다야. 그러나 각 유전자는 특정 유전자를 끄는 박테리아 클론을 나타냅니다. 그런 다음 리포터의 형광을 측정하여 해당 유전자를 끄는 것이 경로에 어떤 영향을 미치는지 결정할 수 있습니다.
높은 반응자와 낮은 반응자는 두 가지 이유 때문에 존재합니다. 1: 실험이 실제로 작동하는지 확인하기 위함이고 2: 내 분석에서 기대할 수 있는 반응 수준에 대한 대략적인 아이디어를 얻기 위함입니다. 적어도 내 분야가 현재 알고 있는 한, 높거나 낮은 반응자는 내가 연구하고 있는 유전자 경로의 주요 억제제이자 활성화제입니다. 다른 400개의 유전자는 이전 실험에서 이 경로에 영향을 미치는 것으로 의심됩니다.
컨트롤은 유전자 특이적이 아니라 빈/모의 벡터 컨트롤 풀이기 때문에 데이터 테이블은 동일한 컨트롤 풀이 각 유전자에 대해 참조되어야 하도록 구조화되어야 함을 의미합니다. 또한 플레이트 사이와 실행 사이에도 약간의 정규화가 있을 것입니다.
정답- 빈 벡터 컨트롤은 각 유전자에 대한 일반적인 참조입니다. 나는 실행 사이의 정규화가 매우 필요하다고 생각합니다. 판 사이도 도움이 될 수 있지만 적어도 대략적인 평균을 사용하면 내가 보는 것과 차이가 크지 않습니다. jmp에서 이를 빠르게 확인할 수 있는 방법이 있다면 그 방법을 알고 싶습니다.
