RNAiスクリーニング私は3回行われた3つの技術的複製を含むRNAiデータセットを持っています。例えば：
実行1
遺伝子X45
遺伝子X59
遺伝子X51
コントロール90
実行2
遺伝子X145
遺伝子X159
遺伝子X151
コントロール190
実行3
遺伝子X35
遺伝子X39
遺伝子X31
コントロール50
実際のデータセットには、実験ごとに数百の遺伝子と数十のコントロールがあります。 各実行の平均は異なる傾向がありますが、実験は同じでした。 これは室内の湿度によるものだと思いますが、結局は関係ありません。 私の興味は、実行のバリエーションではなく、遺伝子にあります。 基本的に、どの遺伝子がコントロールと異なるか、そして確率（p値？）を確認したいと思います。 JMPでこのデータを分析するための最良のアプローチは何ですか？
データ表DOERe：RNAiスクリーニングやあ@thestrider
このプロセスをご案内させていただきます。
私の最終的な応答はこれらの回答に依存するため、いくつかの説明/検証の質問があります。
- それで、あなたのデータのテーブルはこのように見えますが、多くの遺伝子がありますか？
- 実行ごとに1つのコントロールしかありませんが、同じ実行内の同じ条件の3つの技術的測定値がありますか（上の表のように）？
- 条件xが1つの実験条件であり、遺伝子xの技術的な複製が3つあり、実験に多くの条件（条件x、y、zなど）があるようなものはありますか？
- あなたがより正確で適切な私の答え/解決策を与えることができる限り多くの詳細があります。データの出力がどのように見えるかさえ役に立ちます。
ありがとう、
Re：RNAiスクリーニングこんにちはクリス！
あなたは正しいです、私のデータセットはあなたの写真とほとんど同じように見えます、400の遺伝子（遺伝子x、y、zなど）と検証のためだけのいくつかのメタデータがあります。 （すなわち、96ウェルマイクロプレートの位置、プレート名など）
各実行には多くのコントロールがあり、一部は空のベクター（ベースライン、効果なし）、その他は高または低応答を生成する既知の遺伝子です。 すべてのマイクロプレートにはコントロールがあり、3回の実行のそれぞれでコントロールのみのマイクロプレートもテストしました。 私のデータセットの約15％（15000回の測定値のうち約2000回）がコントロールです。
- 条件xが1つの実験条件であり、遺伝子xの技術的な複製が3つあり、実験に多くの条件（条件x、y、zなど）があるようなものがありますか？
これはそれを説明する良い方法だと思います。 リスト内の各遺伝子は、オフにされた遺伝子です。 そこで、400個の遺伝子を一度に1つずつオフにしました。 各実行で、各マイクロプレートの3つの同一のコピーがあったので、各遺伝子の3つの技術的な複製があります。 ここで、データの約15％がランダムに打ち切られた（細菌が増殖しなかった、汚染されたなど）ため、遺伝子に3つの技術的複製がない場合があることに注意してください。 次に、この実験全体を同じ方法でさらに2回繰り返しました。 したがって、理想的な世界では、条件ごとに9つのデータポイントがあります。 ただし、打ち切りはランダムであるため、一部の遺伝子には4〜5個のデータポイントしかありません。
空のベクターコントロールの平均は、3つの実験すべてで異なります。 しかし、各遺伝子の反応は類似しているはずです。 したがって、ベースラインから値を下げる遺伝子は常に値を下げる必要がありますが、数値自体は3回の実行で大幅に変化することがあります。したがって、遺伝子Xは、ある実行では70対100の平均ベースラインの値を持つ可能性がありますが、次の実行では120対300のベースラインの値になります。 正規化する必要があるかもしれないと思ったのですが、データが尾行されるのではないかと心配しており、それを行うための統計がわかりません。 私は蛍光レベルを測定していますが、基本的に薄暗いものはそれほど暗くなりませんが、明るいものは非常に明るくなる可能性があります。 つまり、テールとは、先ほど示した例では、明るい遺伝子は350対100のベースラインである可能性がありますが、次の実行では1200対300のベースラインである可能性があります。 つまり、スケールの上限には大きな数値範囲がありますが、下限には小さい範囲があります。 それが理にかなっていることを願っています。
私は小さなパワーポイントを付けました、それは私が測定しているもの（c。elegans線虫）とデータのサンプリングを示しています。
Re：RNAiスクリーニングありがとう@thestrider 、
はい、ここで対処する必要のあることが複数あります。 統計的アドバイスを提供しないようにアドバイスされているため、統計的に何をすべきか（どの分析を行う必要があるか、または制御値や治療値のシフトなどの外部要因による実行間の変動に対処する方法）を伝えることはできませんこれらの問題のそれぞれをどのように処理するかについてですが、JMP内のどのプラットフォームがそれらのいくつかに対処するのに役立つかを指摘できます
実行ごとに1つのコントロールしかなく、その比較を行うために実行内変動の変動性を評価する方法がないため、実行内統計比較を行うことはできません（少なくとも私が知っている従来の統計手法では）。3つのコントロールがあるため、実行間の変動を推定できますが、対象の状態に対して最大9つの可能な測定値を持つことができるため、バイアスがかかります。これは不均衡と見なされ、不均等な分散をもたらす可能性があります。ありがたいことに、JMPには、Fit Y by Xプラットフォームの不均等な分散に対処する手段があります（Yの遺伝子X応答、応答セクションとXの条件、ファクターセクション）。次に、赤い三角形からt検定を選択します。これにより、各グループの平均と、分散が等しくないと仮定して、条件がコントロールと異なるかどうかをテストするためのp値が得られます。 打ち切られたデータは基本的に欠落データであり（与えられた理由のために測定できません）、実行ごとにそのような問題に対応するために技術的な複製を追加した理由は理にかなっています。
また、前述のように、値は、ほぼマッチペアの状況（または対応のあるt検定のような状況）またはバッチ効果のように、コントロールを含めて1つの実行から別の実行にシフトします。 したがって、この追加のバイアスのために統計的な違いがあるかどうかを確認するには、上記だけでは十分ではありません。 これに対処する方法はたくさんあります。 1つは、実行と条件が効果である重回帰を実行することです（バッチと条件のようなもので、バッチ効果を探してそれらに対応します）。
この場合、Fit Modelは、パーソナリティがあなたのケースに最も適切であるかもしれないテスト/分析のタイプにあなたを導くので、標準最小二乗を使用して選択するためのプラットフォームです。 最初に、実行、条件、および実行と条件の相互作用をモデル効果として配置し、次にGene X応答をYとして配置することにより、実行効果があるかどうかをテストします。これはすべての遺伝子に対して行うことができます（そして、何百もの遺伝子を探すのは大変なことです）。 あなたが持っている小さな例のデータ、私はこれを行いました、そして実行ごとの変動性による影響は間違いなくあります、それはあなたが実行する統計的検定でそれを説明しなければならないことを意味します。
JMPテーブルを作成し、Fit Y byXとFitModel分析をデータテーブルに保存したので、各テストをどのように実行したかを確認できます。 この投稿に添付されています。
社内の統計家に連絡するか、私たちの優雅なコミュニティメンバーの1人があなたの状況をどのように扱うのが最善かについてアドバイスしてくれるかどうかを確認するのが最善です。 多分また無料を取る産業問題解決のための統計的思考コースは、この状況で役立つ可能性のある統計についてさらに学ぶのに役立つ可能性があります。またはを見てください統計知識ポータルより統計的なスキルアップのために。
申し訳ありませんが、必要な統計的アドバイスを提供することはできませんが、少なくともJMPのどこでデータを分析し、実験を評価して条件の重要性をテストできるかを指摘したいと思います。
一番、
Re：RNAiスクリーニング
@Chris_Kirchberg書きました：
実行ごとに1つのコントロールしかなく、その比較を行うために実行内の変動の変動性を評価する方法がないため、実行内の統計的比較を行うことはできません。
こんにちはクリス、信じられないほど役立つこれに感謝します。 私はこの部分に少し混乱しています。申し訳ありませんが、はっきりしていませんでしたが、3回の実行ごとに約210個の空のベクトル制御データポイントがあります。 それらは私が行ったすべてのマイクロプレート（実行ごとに18プレート）に広がっていますが、それ以外は同じです。また、既知のハイレスポンダーとローレスポンダーを使用した同様の数のコントロールがあります。
Re：RNAiスクリーニングやあ@thestrider 、
説明をありがとう。 実行ごとに遺伝子ごとに1つのコントロール測定しかないと思いました。これは今ではもっと理にかなっています。
各ランで使用される18枚のプレートにも400個の遺伝子が分散していると思いますか？ 各遺伝子の各技術的複製は異なるプレートに配置されていますか？ つまり、プレートごとに11個または12個の空のコントロールがあり、プレートごとに約22個の個別の遺伝子がテストされているということです。 あれは正しいですか？
これを分析するためのアプローチは、実験計画と各技術的複製の配置、プレート全体の遺伝子、および空の（モック）、低応答、高応答の使用方法によって異なります。 JMPの適切なフィールドに適切な変数を割り当てる方法（Fit Model、Fit Y by Y、さらには応答スクリーニングなど）は、それに依存します。 データテーブルの構成方法についても同じです。
コントロールは遺伝子固有ではなく、空/モックベクターコントロールのプールであるため、データテーブルは、コントロールの同じプールが各遺伝子の参照である必要があるように構造化する必要があります。 また、プレート間および実行間でもある程度の正規化が行われます。
コミュニティや組織の誰かが、このデータを正規化する方法と、データに使用するためにFitModelまたはResponseScreeningのいずれかを使用できるようにデータを構造化する方法をアドバイスできるかもしれません。 これらは、この場合にデータを分析するためにおそらく使用する2つのプラットフォームです。
申し訳ありませんが、分析へのアプローチ方法の詳細についてはご案内できませんでした。
一番、
Re：RNAiスクリーニング実験計画の観点から、最初の質問はそれでした。 コントロールと比較して遺伝子がどのように反応するかを決定することに興味があるようです。 しかし、あなたには複数の種類のコントロールがあり、各コントロールの目的が何であったかはわかりません。 たとえば、プレート全体から真のネガティブコントロール平均を差し引いてバックグラウンドを差し引いた後、プレート上の遺伝子をハウスキーピング遺伝子に正規化して、遺伝子のシグナルが何かに対してアップレギュレーションされているかダウンレギュレーションされているかを判断します。構成的に表現されます。 あるいは、最大限に発現する遺伝子に正規化するかもしれません...
ここでの追加の問題は、18枚のプレートのそれぞれが大きく異なるダイナミックレンジを持っているように聞こえることです。 そして、そのノイズに加えて、繰り返される実験全体のダイナミックレンジもかなりのものです。
1つのアプローチは、批評家がいると確信していますが、各プレートのバックグラウンド減算と正規化を実行してから、応答を中央に配置してスケーリングするか、応答を0-1にスケーリングします。これにより、プレートのダイナミックレンジが各プレートで同一になります。
この問題に取り組んだので、分析するものがまだあると仮定して、各実験複製のプレート全体の遺伝子平均を調べ、実験複製から遺伝子の平均を取得します（中心極限定理でのダブルディッピング）定理とその正当性。）
技術的な複製が3つか4つしかないように思われるので、シグマの推定はそのサンプルサイズでは少し大雑把ですが、％CVを調べて、各遺伝子のデータが解釈可能かどうかを判断するためのしきい値を設定する場合があります。
このアドバイスのすべてが認められているのは、実験的にどのように、何をしたのか、あるいは実際のデータが漠然とどのように見えるのかさえわからないことに基づいています。 したがって、これは役立つか、まったく役に立たないかもしれませんが、前者の場合はうまくいきます。
-NS
Re：RNAiスクリーニング
@Chris_Kirchberg書きました：
やあ@thestrider 、
各ランで使用される18枚のプレートにも400個の遺伝子が分散していると思いますか？ 各遺伝子の各技術的複製は異なるプレートに配置されていますか？ つまり、プレートごとに11個または12個の空のコントロールと、プレートごとにテストされた約22個の個別の遺伝子を意味します。 あれは正しいですか？
これを分析するためのアプローチは、実験計画と各技術的複製の配置、プレート全体の遺伝子、および空の（モック）、低応答、高応答の使用方法によって異なります。 JMPの適切なフィールドに適切な変数を割り当てる方法（Fit Model、Fit Y by Y、さらには応答スクリーニングなど）は、それに依存します。 データテーブルの構成方法についても同じです。
あなたは近くにいて、各プレートには11〜12個のコントロールがあり、5つの異なるマイクロプレートに約80個の遺伝子が広がっています。 6番目のマイクロプレートは、プレート全体に散在するコントロールです。 各プレートの3つのコピーを実行ごとに分析し、合計18枚のプレートを作成しました。 したがって、各遺伝子の各技術的複製は3つのプレート上にあります。 空のベクターコントロールが最も重要です。これらは、実験の分散を決定し、ベースライン応答率を確立するために使用されました。
実験のしくみ-動物にはバクテリアが与えられます。 空のベクトルでは、それだけです。 しかし、各遺伝子は、その特定の遺伝子をオフにする細菌のクローンを表しています。 次に、レポーターの蛍光を測定して、その遺伝子をオフにすることが経路にどのように影響するかを判断できます。
高応答者と低応答者には2つの理由があります。1：実験が実際に機能していることを確認するため、および2：アッセイから期待できる応答レベルの大まかなアイデアを取得するため。 少なくとも私の分野が現在知っている限り、高応答者と低応答者は、私が研究している遺伝子経路の主要な阻害剤と活性化因子です。 他の400の遺伝子は、以前の実験でこの経路に影響を及ぼしていると疑われています。
コントロールは遺伝子固有ではなく、空/モックベクターコントロールのプールであるため、データテーブルは、コントロールの同じプールが各遺伝子の参照である必要があるように構造化する必要があります。 また、プレート間および実行間でもある程度の正規化が行われます。
正解-空のベクターコントロールは、各遺伝子の一般的なリファレンスです。 実行間の正規化は非常に必要だと思います。 プレート間の分散も役立つ可能性がありますが、少なくとも大まかな平均を使用すると、分散は私が見たものほど大きくはありません。 jmpでこれをすばやく確認する方法がある場合は、その方法を知りたいと思います。
