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Screening RNAi

Ho un set di dati RNAi con 3 repliche tecniche, realizzate in triplice copia. Ad esempio:

Corsa 1

gene X 45

gene X 59

gene X 51

Controllo 90

Corsa 2

gene X 145

gene X 159

gene X 151

Controllo 190

Corsa 3

gene X 35

gene X 39

gene X 31

Controllo 50

Il set di dati reale contiene centinaia di geni e decine di controlli per esperimento. Ogni serie tende a variare nella sua media, ma gli esperimenti erano gli stessi. Credo che ciò sia dovuto all'umidità ambientale, ma alla fine non ha importanza. Il mio interesse sono i geni, non la variabilità della serie. Voglio fondamentalmente vedere quali geni variano rispetto al controllo e una probabilità (valore p?). Qual è l'approccio migliore per analizzare questi dati con JMP?

Ingegneria della qualità e dei processiRe: Screening RNAi

Ciao @thestrider

Sarei felice di guidarti attraverso questo processo.

Ho alcune domande di chiarimento/verifica poiché la mia risposta definitiva dipenderà da queste risposte.

1. Quindi la tua tabella di dati è simile a questa ma con molti geni?

1. C'è solo un controllo per corsa ma tre misurazioni tecniche della stessa condizione all'interno della stessa corsa (come nella tabella sopra)?
2. Hai qualcosa come la condizione x è una condizione sperimentale, con tre repliche tecniche per il gene x, e hai molte condizioni per l'esperimento (condizione x, y, z, ecc.)?
3. Più dettagli puoi fornire, più accurata e appropriata sarà la mia risposta/soluzione.Anche l'aspetto dell'output dei tuoi dati aiuta.

Grazie,

 

 

Re: Screening RNAi

Ciao chris!

 

Hai ragione, il mio set di dati sembra quasi esattamente come la tua immagine, con 400 geni (gene x, y, z, ecc.) (es. posizione della micropiastra a 96 pozzetti, nome della piastra ecc.)

 

Ogni corsa ha molti controlli, alcuni sono vettori vuoti (baseline, nessun effetto) altri sono geni noti che generano risposte alte o basse. Ogni micropiastra aveva dei controlli e abbiamo anche testato una micropiastra solo di controllo in ciascuna delle tre analisi. Circa il 15% del mio set di dati (~ 2000 di 15000 misurazioni) è costituito da controlli.

 

1. Hai qualcosa come la condizione x è una condizione sperimentale, con tre repliche tecniche per il gene x, e hai molte condizioni per l'esperimento (condizione x, y, z, ecc.)

Penso che questo sia un buon modo per descriverlo. Ogni gene nell'elenco è un gene che è stato disattivato. Quindi ho disattivato 400 geni, uno alla volta. In ogni analisi ho avuto tre copie identiche di ogni micropiastra, quindi ci sono 3 repliche tecniche di ogni gene. Dovrei notare qui che in modo casuale circa il 15% dei dati è stato censurato (i batteri non sono cresciuti, contaminati, ecc.), Quindi a volte i geni non hanno 3 repliche tecniche. Ho quindi ripetuto l'intero esperimento allo stesso modo altre due volte. Quindi in un mondo ideale ho 9 punti dati per condizione. La censura è casuale, quindi alcuni geni hanno solo 4-5 punti dati.

 

La media del controllo del vettore vuoto varia in tutti e tre gli esperimenti. Ma la risposta di ogni gene dovrebbe essere simile. Quindi un gene che abbassa il valore dalla linea di base dovrebbe sempre abbassarlo, ma i numeri stessi variano a volte drasticamente nelle tre serie.Quindi il gene X potrebbe avere un valore, diciamo, di 70 rispetto a una linea di base media di 100 in una corsa, ma un valore di 120 rispetto a una linea di base di 300 nella successiva. Pensavo di dover normalizzare, ma sono preoccupato che i dati possano essere pedinati e non sono sicuro delle statistiche per farlo. Sto misurando i livelli di fluorescenza e fondamentalmente le cose deboli non diventano molto più deboli, ma le cose luminose possono diventare molto luminose. Quindi per coda intendo nell'esempio che ho appena fornito, un gene luminoso potrebbe essere 350 contro 100 di base, ma nella prossima esecuzione potrebbe essere 1200 contro 300 di base. In altre parole c'è un grande intervallo numerico nella fascia alta della scala, ma nella fascia bassa c'è una gamma più piccola. Spero che abbia un senso.

 

Ho allegato un piccolo powerpoint, mostra ciò che sto misurando, (c. elegans nematodes) e un campionamento di dati.

 

 

Re: Screening RNAi

Grazie @thestrider ,

Sì, ci sono molte cose che devono essere affrontate qui. Non posso dirti cosa dovresti fare statisticamente (quale analisi dovresti fare o come affrontare la variabilità tra le sessioni dovuta a fattori esterni, come lo spostamento dei valori di controllo e di trattamento) poiché si consiglia di non dare consigli statistici su come trattare ciascuno di questi problemi, ma posso indicarti quali piattaforme all'interno di JMP potrebbero aiutare a risolverne alcuni

 

Non è possibile effettuare confronti statistici all'interno della corsa poiché esiste un solo controllo per esecuzione e non è possibile valutare la variabilità per la variazione durante la corsa per effettuare tale confronto (almeno non con i metodi statistici tradizionali di cui sono a conoscenza).La variazione tra le serie può essere stimata poiché ci sono tre controlli, ma sarà distorta perché è possibile avere fino a 9 misurazioni possibili per la condizione di interesse.Questo sarebbe considerato sbilanciato e potrebbe darti una varianza diseguale.Fortunatamente, JMP ha un mezzo per gestire la varianza diseguale nella piattaforma Fit Y by X (risposta del gene X nella sezione Y, risposta e condizione nella sezione X, fattore).Quindi scegli t-Test dal triangolo rosso che ti darà le medie per ciascun gruppo e un valore p per verificare se la condizione è diversa dal controllo, assumendo una varianza diseguale. I dati censurati sono fondamentalmente dati mancanti (non misurabili a causa del motivo fornito) e ha senso il motivo per cui sono state aggiunte repliche tecniche per risolvere tali problemi per ogni esecuzione.

 

Inoltre, come hai già detto, i valori si spostano da una corsa all'altra, incluso il controllo, quasi come una situazione di corrispondenza di una coppia (o una situazione simile a un test t accoppiato) o un effetto batch. Quindi quanto sopra da solo non è sufficiente per vedere se c'è una differenza statistica a causa di questa distorsione aggiuntiva. Potrebbero esserci molti modi per affrontare questo problema. Uno potrebbe essere quello di eseguire una regressione multipla in cui run e condition sono effetti (un po' come batch e condition alla ricerca di effetti batch e adattandoli).

 

In questo caso, Fit Model è la piattaforma da utilizzare e scegliendo Standard Least Squares poiché la personalità ti porterà al tipo di test/analisi che potrebbe essere più appropriato nel tuo caso. Prima proverei a vedere se c'è un effetto corsa mettendo corsa, condizione e l'interazione di corsa e condizione come effetti del modello e quindi la risposta del gene X come Y.Potresti farlo per tutti i geni (e sarebbe molto da guardare per centinaia di geni). I piccoli dati di esempio che hai, l'ho fatto e c'è sicuramente un effetto dovuto alla variabilità da corsa a corsa, quindi ciò significa che deve essere preso in considerazione nei test statistici che esegui.

Ho creato una tabella JMP e salvato le analisi Fit Y by X e Fit Model nella tabella dati in modo da poter vedere come ho eseguito ogni test. È allegato a questo post.

 

È meglio contattare uno statistico in casa o vedere se uno dei nostri gentili membri della comunità è disposto a consigliare il modo migliore per trattare la tua situazione. Magari prendi anche il libero Pensiero statistico per la risoluzione dei problemi industriali corso potrebbe aiutare a saperne di più sulle statistiche che potrebbero aiutare in questa situazione.Oppure dai un'occhiata al Portale della conoscenza delle statistiche per un ulteriore miglioramento statistico.

 

Mi dispiace non essere in grado di fornire i consigli statistici di cui potresti aver bisogno, ma spero di aver almeno indicato dove in JMP potresti andare per analizzare i tuoi dati e valutare l'esperimento e testare la significatività delle condizioni.

 

Migliore,

Re: Screening RNAi

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@Chris_Kirchberg ha scritto:

 

Non è possibile effettuare confronti statistici durante la corsa poiché esiste un solo controllo per corsa e non è possibile valutare la variabilità per la variazione durante la corsa per effettuare tale confronto

 

Ciao Chris, grazie mille per questo che è incredibilmente utile. Sono un po 'confuso da questa parte, scusa se non sono stato chiaro, ma ho ~ 210 punti dati di controllo vettoriale vuoti per ciascuna delle mie tre esecuzioni. Sono distribuiti su ogni micropiastra che ho eseguito (18 piastre per corsa), ma per il resto sono identici.Ho anche un numero simile di controlli che utilizzano risponditori alti e bassi noti.

Re: Screening RNAi

Ciao @thestrider ,

 

Grazie per il chiarimento. Pensavo avessi solo una misurazione di controllo per gene per corsa.Questo ha più senso ora.

 

Presumo che i 400 geni siano sparsi anche tra le 18 piastre utilizzate in ogni corsa? Ogni replica tecnica per ogni gene è posta su una piastra diversa? Quindi questo significa 11 o 12 controlli vuoti per piastra e circa 22 geni individuali testati per piastra. È corretto?

 

L'approccio all'analisi dipende dalla progettazione dell'esperimento e dal posizionamento di ogni replica tecnica e dei geni attraverso le piastre, nonché da come devono essere utilizzati i risponditori vuoti (falsi), bassi e alti. Il modo in cui assegnare le variabili giuste ai campi giusti in JMP (come Fit Model, Fit Y by Y o anche Response Screening) dipenderà da questo. Stessa cosa per come strutturare la tabella dati.

 

Poiché i controlli non sono specifici del gene, ma un pool di controlli vettoriali vuoti/mock, ciò significa che la tabella dei dati deve essere strutturata in modo tale che lo stesso pool di controlli debba essere di riferimento per ciascun gene. Inoltre, ci sarà una certa normalizzazione tra le piastre e anche tra le esecuzioni.

 

Forse qualcuno nella comunità o nella tua organizzazione può consigliare come normalizzare questi dati e come strutturarli in modo che si possa utilizzare Fit Model o Response Screening da utilizzare per i tuoi dati. Queste sono le due piattaforme che probabilmente utilizzerei per analizzare i dati in questo caso.

 

Mi dispiace non poterti guidare nei dettagli più fini di come ti avvicineresti all'analisi.

 

Migliore,

Re: Screening RNAi

Solo da una prospettiva di progettazione sperimentale, vorrei capire che la domanda originale era. Sembra che tu sia interessato a determinare come risponde un gene rispetto a un controllo. Ma hai più tipi di controlli e non mi è chiaro quale fosse l'obiettivo di ciascun controllo. Ad esempio, potrei sottrarre la vera media del controllo negativo dall'intera piastra, per sottrarre lo sfondo, quindi potrei normalizzare i geni sulla piastra a un gene housekeeping per determinare se il segnale del gene era regolato su o giù rispetto a qualcosa che è costitutivamente espresso. O magari normalizzarsi a un gene che è espresso al massimo...

Il problema aggiuntivo qui è che sembra che ciascuna delle 18 piastre abbia una gamma dinamica molto diversa. E oltre a quel rumore, anche la gamma dinamica negli esperimenti ripetuti è considerevole.

Un approccio, e sono sicuro che ci saranno critiche, è quello di eseguire la sottrazione e la normalizzazione dello sfondo per ogni piastra, quindi centrare e ridimensionare la risposta o ridimensionare la risposta a 0-1. Ciò obbliga la gamma dinamica della piastra ad essere identica per ciascuna piastra.

Ora che abbiamo affrontato il problema, supponendo che ci sia ancora qualcosa da analizzare, potremmo guardare le medie dei geni attraverso le piastre in ogni replica sperimentale e quindi prendere la media dei geni dalle repliche sperimentali (sì, doppia immersione sui limiti centrali teorema, e la sua legittimità.)

Sembra che tu abbia solo 3 o 4 repliche tecniche, quindi stimare il sigma è un po' approssimativo con quella dimensione del campione, ma potrei guardare la %CV e impostare una soglia per determinare se i dati per ciascun gene sono interpretabili.

Concesso tutto questo consiglio si basa sul fatto di non avere idea di come o cosa hai fatto sperimentalmente o anche di come siano anche vagamente i dati reali. Quindi questo potrebbe essere utile o completamente inutile, ma si spera il primo.

-B

Re: Screening RNAi

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@Chris_Kirchberg ha scritto:

Ciao @thestrider ,

 

Presumo che i 400 geni siano sparsi anche tra le 18 piastre utilizzate in ogni corsa? Ogni replica tecnica per ogni gene è posta su una piastra diversa? Quindi questo significa 11 o 12 controlli vuoti per piastra e circa 22 geni individuali testati per piastra. È corretto?

 

L'approccio all'analisi dipende dalla progettazione dell'esperimento e dal posizionamento di ogni replica tecnica e dei geni attraverso le piastre, nonché da come devono essere utilizzati i risponditori vuoti (falsi), bassi e alti. Il modo in cui assegnare le variabili giuste ai campi giusti in JMP (come Fit Model, Fit Y by Y o anche Response Screening) dipenderà da questo. Stessa cosa per come strutturare la tabella dati.

 

 

 

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Sei vicino, ogni piastra ha 11-12 controlli e ~ 80 geni distribuiti su 5 diverse micropiastre. Una sesta micropiastra è costituita solo da controlli sparsi su una piastra. Sono state analizzate 3 copie di ciascuna piastra per corsa, per un totale di 18 piastre. Ogni replica tecnica per ogni gene è quindi su 3 piastre. I controlli vettoriali vuoti sono i più importanti, dovevano essere usati per determinare la varianza nei miei esperimenti e stabilire un tasso di risposta di base.

 

Il modo in cui funziona l'esperimento: gli animali vengono nutriti con un batterio. Nel vettore vuoto, questo è tutto. Ma ogni gene rappresenta un clone batterico che disattiva quel gene specifico. Posso quindi misurare la fluorescenza di un giornalista per determinare come la disattivazione di quel gene influenza un percorso.

 

I responsi alti e bassi sono presenti per due motivi: 1: per stabilire che l'esperimento sta effettivamente funzionando e 2: per avere un'idea approssimativa del livello di risposta che possiamo aspettarci dal mio test. I responder alti e bassi sono i principali inibitori e attivatori della via genica che sto studiando, almeno per quanto ne sa il mio campo. Si sospetta che gli altri 400 geni abbiano un effetto su questo percorso in un esperimento precedente.

 

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Poiché i controlli non sono specifici del gene, ma un pool di controlli vettoriali vuoti/mock, ciò significa che la tabella dei dati deve essere strutturata in modo tale che lo stesso pool di controlli debba essere di riferimento per ciascun gene. Inoltre, ci sarà una certa normalizzazione tra le piastre e anche tra le esecuzioni.

 

 

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Corretto: i controlli vettoriali vuoti sono un riferimento generale per ciascun gene. Penso che la normalizzazione tra le esecuzioni sia molto necessaria. Anche tra i piatti potrebbe essere utile, ma la varianza non è così grande da quello che vedo, almeno usando medie approssimative. Se c'è un modo per verificarlo rapidamente in jmp, mi piacerebbe sapere come farlo.

Ri: Screening RNAi

Innanzitutto, grazie mille per tutte le risposte. Sono davvero sbalordito da tutto l'aiuto che sto ricevendo da questa community, è incredibile.

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@Byron_JMP ha scritto:

Solo da una prospettiva di progettazione sperimentale, vorrei arrivare a quello che era la domanda originale. Sembra che tu sia interessato a determinare come un gene risponde rispetto a un controllo. Ma hai più tipi di controlli e non ho chiaro quale fosse l'obiettivo di ogni controllo. Ad esempio, potrei sottrarre la media del controllo negativo reale dall'intera piastra, per sottrarre lo sfondo, quindi potrei normalizzare i geni sulla piastra a un gene housekeeping per determinare se il segnale del gene è stato regolato positivamente o negativamente rispetto a qualcosa che è espresso in modo costitutivo. O forse normalizzare a un gene che è espresso al massimo...

L'obiettivo era scoprire geni che hanno un effetto su un percorso usando un reporter fluorescente. Il vettore vuoto è la mia linea di base, mostra cosa succede quando non faccio nulla. Quindi è più o meno analogo all'uso di un gene housekeeping. Il positivo e il negativo sono lì solo per vedere se la mia interferenza dell'RNA funziona (inducendo l'abbattimento di un gene specifico) e per avere un'idea approssimativa dell'intervallo di fluorescenza nel mio test. Come potrei fare la normalizzazione al vettore vuoto usando JMP? Anche questo è qualcosa che ho pensato sarebbe stato utile e sono contento di sentire che la pensi allo stesso modo.

Il problema aggiuntivo qui è che sembra che ciascuna delle 18 piastre abbia un range dinamico estremamente diverso. E oltre a quel rumore, il range dinamico attraverso gli esperimenti ripetuti è anche considerevole.

Nota: le 18 piastre in una serie non hanno un range dinamico molto diverso. Sembra ragionevole tra le piastre e non vedo molta differenza neanche in base alla posizione della piastra. Il drastico cambiamento del range dinamico si vede davvero quando ho replicato l'esperimento due volte (ho 54 piastre di dati). Le repliche avrebbero dovuto essere identiche, ma credo che ci fosse una giornata umida. Il mio reporter è sensibile all'ossigeno...

Un approccio, e sono sicuro che ci saranno delle critiche, è quello di eseguire la sottrazione dello sfondo e la normalizzazione per ogni piastra, quindi centrare e scalare la risposta, oppure scalare la risposta a 0-1. Ciò forza la gamma dinamica della piastra a essere identica per ogni piastra.

Ora che abbiamo affrontato il problema, supponendo che ci sia ancora qualcosa da analizzare, potremmo osservare le medie dei geni nelle piastre in ogni replica sperimentale e poi calcolare la media dei geni dalle repliche sperimentali (sì, doppia immersione nel teorema dei limiti centrali, ed è legittimo).

Sembra interessante, come potrei farlo in JMP?

Sembra che tu abbia solo 3 o 4 repliche tecniche, quindi la stima di sigma è un po' approssimativa con quella dimensione del campione, ma potrei dare un'occhiata al %CV e stabilire una soglia per determinare se i dati per ciascun gene sono interpretabili.

Ho fino a 9 punti dati, 1 punto da 3 micropiastre (repliche tecniche) ciascuna di tre giorni di esperimenti identici. (repliche biologiche) Per questo tipo di screening, nel mio campo ci sono articoli pubblicati senza repliche. Speravo che generando almeno alcune repliche, avrei potuto catturare i risponditori più deboli nel mio set di dati. Come posso impostare una soglia in jmp?

Grazie, è davvero molto utile!

Re: Screening RNAi

Ciao @thestrider ,

Gli strumenti di JMP che probabilmente dovresti usare sono le Formule per Colonne (per creare dati normalizzati da analizzare) e il Modello di Adattamento (la personalità standard dei minimi quadrati in cui definisci la tua risposta e gli effetti del modello, le variabili casuali, le interazioni, ecc.). Il modo in cui creerai una formula per normalizzare i dati e quali effetti del modello ti serviranno per il tuo esperimento dipende da te (dalla tua conoscenza della statistica e dalla tua conoscenza del disegno sperimentale).

Ecco un link a una ricerca riguardante l'analisi dei dati su piastre a 96 pozzetti e la progettazione di esperimenti per formati di piastre a 96 pozzetti all'interno di questo sito della community. Date un'occhiata e dovreste trovare qualche indicazione su come analizzare il tipo di dati in base al formato.

Sono inoltre presenti alcuni link alla documentazione di JMP sulla creazione di formule di colonna e modelli di adattamento utilizzando i minimi quadrati standard .

Spero che questo ti aiuti a capire dove eseguire queste attività in JMP.

Saluti,