RNAi-ScreeningIch habe einen RNAi-Datensatz mit 3 technischen Replikaten, der in dreifacher Ausführung durchgeführt wurde.Beispielsweise:
Lauf 1
Gen X 45
Gen X 59
Gen X 51
Steuerung 90
Lauf 2
Gen X 145
Gen X 159
Gen X 151
Steuerung 190
Lauf 3
Gen X 35
Gen X 39
Gen X 31
Steuerung 50
Der reale Datensatz enthält Hunderte von Genen und Dutzende von Kontrollen pro Experiment. Jeder Durchlauf neigt dazu, im Durchschnitt zu variieren, aber die Experimente waren die gleichen. Ich denke, das liegt an der Raumluftfeuchtigkeit, aber das spielt am Ende keine Rolle. Mein Interesse gilt den Genen, nicht der Laufvariation. Ich möchte grundsätzlich sehen, welche Gene von der Kontrolle abweichen und eine Wahrscheinlichkeit (p-Wert?). Was ist der beste Ansatz, um diese Daten mit JMP zu analysieren?
DatentabelleDAMHIRSCHKUHRe: RNAi-ScreeningHallo @thestrider
Gerne begleite ich Sie durch diesen Prozess.
Ich habe einige Klärungs-/Verifizierungsfragen, da meine endgültige Antwort von diesen Antworten abhängt.
- Sieht Ihre Datentabelle also etwa so aus, aber mit vielen Genen?
- Gibt es nur eine Kontrolle pro Lauf, aber drei technische Messungen des gleichen Zustands innerhalb desselben Laufs (wie in der Tabelle oben)?
- Haben Sie so etwas wie Bedingung x ist eine experimentelle Bedingung mit drei technischen Replikaten für Gen x, und Sie haben viele Bedingungen für das Experiment (Bedingung x, y, z usw.)?
- So viele Details Sie geben können, desto genauer und angemessener wird meine Antwort/Lösung sein.Sogar wie die Ausgabe Ihrer Daten aussieht, hilft.
Vielen Dank,
Re: RNAi-ScreeningHallo Chris!
Sie haben Recht, mein Datensatz sieht fast genauso aus wie Ihr Bild, mit 400 Genen (Gen x, y, z usw.) und einigen weiteren Metadaten, die nur zur Validierung dienen. (dh Standort der 96-Well-Mikrotiterplatte, Plattenname usw.)
Jeder Lauf hat viele Kontrollen, einige sind leere Vektoren, (Grundlinie, keine Wirkung) andere sind bekannte Gene, die hohe oder niedrige Reaktionen erzeugen. Jede Mikrotiterplatte hatte Kontrollen, und wir haben auch nur eine Kontroll-Mikrotiterplatte in jedem der drei Durchläufe getestet. Etwa 15% meines Datensatzes (~2000 von 15000 Messungen) sind Kontrollen.
- Haben Sie so etwas wie Bedingung x ist eine experimentelle Bedingung mit drei technischen Replikaten für Gen x, und Sie haben viele Bedingungen für das Experiment (Bedingung x, y, z usw.)
Ich denke, das ist eine gute Möglichkeit, es zu beschreiben. Jedes Gen in der Liste ist ein Gen, das ausgeschaltet wurde. Also habe ich 400 Gene nacheinander abgeschaltet. In jedem Durchlauf hatte ich drei identische Kopien jeder Mikrotiterplatte, also gibt es 3 technische Replikate jedes Gens. Ich sollte hier anmerken, dass etwa 15% der Daten zufällig zensiert wurden (Bakterien wuchsen nicht, kontaminiert usw.), sodass Gene manchmal keine 3 technischen Replikate haben. Dieses ganze Experiment habe ich dann noch zweimal auf die gleiche Weise wiederholt. In einer idealen Welt habe ich also 9 Datenpunkte pro Bedingung. Die Zensur ist jedoch zufällig, sodass einige Gene nur 4-5 Datenpunkte haben.
Der Mittelwert der Leervektorkontrolle variiert über alle drei Experimente hinweg. Aber die Reaktion jedes Gens sollte ähnlich sein. Ein Gen, das den Wert gegenüber dem Ausgangswert senkt, sollte ihn also immer senken, aber die Zahlen selbst variieren manchmal drastisch in den drei Durchläufen.Gen X könnte also in einem Lauf einen Wert von 70 gegenüber einer durchschnittlichen Grundlinie von 100 haben, im nächsten jedoch einen Wert von 120 gegenüber einer Grundlinie von 300. Ich dachte, ich müsste vielleicht normalisieren, aber ich mache mir Sorgen, dass die Daten möglicherweise verfolgt werden, und ich bin unsicher, was die Statistiken dafür tun. Ich messe die Leuchtstoffwerte, und im Grunde werden dunkle Dinge nicht viel dunkler, aber helle Dinge können sehr hell werden. Mit tailed meine ich in dem Beispiel, das ich gerade gegeben habe, ein helles Gen könnte 350 vs. 100 Baseline sein, aber im nächsten Lauf könnte es 1200 vs 300 Baseline sein. Mit anderen Worten, es gibt einen großen Zahlenbereich am oberen Ende der Skala, aber am unteren Ende gibt es einen kleineren Bereich. Ich hoffe das ergibt Sinn.
Ich habe eine kleine Powerpoint-Datei angehängt, die zeigt, was ich messe (c. elegans-Nematoden) und eine Auswahl von Daten.
Re: RNAi-ScreeningVielen Dank @thestrider ,
Ja, hier sind mehrere Dinge zu beachten. Ich kann Ihnen nicht sagen, was Sie statistisch tun sollten (welche Analyse Sie durchführen müssten oder wie Sie die Variabilität zwischen den Durchläufen aufgrund externer Faktoren wie der Verschiebung von Kontroll- und Behandlungswerten angehen können), da wir davon abgeraten werden, statistische Ratschläge zu geben wie man jedes dieser Probleme behandelt, aber ich kann Sie auf die Plattformen innerhalb von JMP hinweisen, die bei der Lösung einiger dieser Probleme helfen könnten
Statistische Vergleiche innerhalb eines Laufs können nicht durchgeführt werden, da es nur eine Kontrolle pro Lauf gibt und es keine Möglichkeit gibt, die Variabilität für die Variation innerhalb des Laufs zu bewerten, um diesen Vergleich anzustellen (zumindest nicht mit herkömmlichen statistischen Methoden, die mir bekannt sind).Die Variation zwischen den Läufen kann geschätzt werden, da es drei Kontrollen gibt, aber sie ist verzerrt, da Sie bis zu 9 mögliche Messungen für den interessierenden Zustand haben können.Dies würde als unausgeglichen gelten und Ihnen möglicherweise eine ungleiche Varianz geben.Glücklicherweise hat JMP ein Mittel, um mit ungleicher Varianz in der Fit Y by X-Plattform umzugehen (Gen X-Antwort im Abschnitt Y, Antwort und Bedingung im Abschnitt X, Faktor).Wählen Sie dann t-Test aus dem roten Dreieck, das Ihnen die Mittelwerte für jede Gruppe und einen p-Wert zum Testen anzeigt, ob sich die Bedingung von der Kontrolle unterscheidet, wobei eine ungleiche Varianz angenommen wird. Bei den zensierten Daten fehlen im Grunde Daten (aus dem angegebenen Grund nicht messbar) und es ist sinnvoll, warum Sie technische Replikate hinzugefügt haben, um solche Probleme für jeden Lauf zu berücksichtigen.
Wie Sie bereits erwähnt haben, verschieben sich die Werte von einem Lauf zum anderen, einschließlich der Kontrolle, fast wie eine Match-Paar-Situation (oder eine gepaarte t-Test-ähnliche Situation) oder ein Batch-Effekt. Das Obige allein reicht also nicht aus, um zu sehen, ob es aufgrund dieser zusätzlichen Verzerrung einen statistischen Unterschied gibt. Es könnte viele Möglichkeiten geben, dies anzugehen. Eine kann darin bestehen, eine multiple Regression durchzuführen, bei der Run und Condition Effekte sind (so ähnlich wie Batch und Condition, die nach Batch-Effekten suchen und diese berücksichtigen).
In diesem Fall ist Fit Model die Plattform für die Verwendung und die Auswahl von Standard Least Squares, da die Persönlichkeit Sie zu der Art von Test/Analyse führt, die in Ihrem Fall am besten geeignet ist. Ich würde zuerst testen, ob es einen Laufeffekt gibt, indem ich Lauf, Bedingung und die Interaktion von Lauf und Bedingung als Modelleffekte und dann die Reaktion von Gen X als Y ansetze.Sie könnten dies für alle Gene tun (und das wäre viel zu sehen für Hunderte von Genen). Die kleinen Beispieldaten, die Sie haben, habe ich getan, und es gibt definitiv einen Effekt aufgrund der Variabilität von Lauf zu Lauf, was bedeutet, dass er in den von Ihnen durchgeführten statistischen Tests berücksichtigt werden muss.
Ich habe eine JMP-Tabelle erstellt und die Fit Y by X- und die Fit Model-Analysen in der Datentabelle gespeichert, damit Sie sehen können, wie ich jeden Test durchgeführt habe. Es ist diesem Beitrag beigefügt.
Es ist am besten, sich entweder an einen Statistiker im Haus zu wenden oder zu sehen, ob eines unserer freundlichen Community-Mitglieder bereit ist, Sie zu beraten, wie Sie Ihre Situation am besten behandeln können. Vielleicht auch das Gratis nehmen Statistisches Denken zur industriellen Problemlösung Kurs könnte helfen, mehr über Statistiken zu erfahren, die in dieser Situation hilfreich sein könnten.Oder werfen Sie einen Blick auf die Statistik-Wissensportal für mehr statistische Weiterbildung.
Es tut mir leid, dass ich Ihnen nicht die statistischen Ratschläge geben kann, die Sie möglicherweise benötigen, aber ich hoffe, ich habe zumindest darauf hingewiesen, wo Sie in JMP Ihre Daten analysieren und das Experiment bewerten und die Signifikanz der Bedingungen testen können.
Am besten,
Re: RNAi-Screening
@Chris_Kirchberg schrieb:
Statistische Vergleiche innerhalb des Laufs können nicht durchgeführt werden, da es nur eine Kontrolle pro Lauf gibt und es keine Möglichkeit gibt, die Variabilität für die Variation innerhalb des Laufs zu beurteilen, um diesen Vergleich anzustellen
Hallo Chris, vielen Dank dafür, das ist unglaublich hilfreich. Ich bin ein wenig verwirrt von diesem Teil, tut mir leid, dass ich mir unklar war, aber ich habe ~ 210 leere Vektorkontrolldatenpunkte für jeden meiner drei Durchläufe. Sie sind auf jede von mir erstellte Mikrotiterplatte verteilt (18 Platten pro Durchlauf), sind aber ansonsten identisch.Ich habe auch eine ähnliche Anzahl von Kontrollen mit bekannten High- und Low-Respondern.
Re: RNAi-ScreeningHallo @thestrider ,
Danke für die Klarstellung. Ich dachte, du hättest nur eine Kontrollmessung pro Gen pro Lauf.Das macht jetzt mehr Sinn.
Ich nehme an, dass die 400 Gene auch auf die 18 Platten verteilt sind, die in jedem Durchlauf verwendet werden? Wird jedes technische Replikat für jedes Gen auf einer anderen Platte platziert? Das bedeutet also entweder 11 oder 12 leere Kontrollen pro Platte und etwa 22 getestete einzelne Gene pro Platte. Ist das korrekt?
Der Ansatz, dies zu analysieren, hängt vom Design des Experiments und der Platzierung jedes technischen Replikats und den Genen auf den Platten sowie davon ab, wie die leeren (Mock-), Low- und High-Responder verwendet werden. Davon hängt ab, wie die richtigen Variablen den richtigen Feldern in JMP zugewiesen werden (wie Fit Model, Fit Y by Y oder sogar Response Screening). Gleiches gilt für die Strukturierung der Datentabelle.
Da die Kontrollen nicht genspezifisch sind, sondern ein Pool von Leer-/Mockvektorkontrollen, bedeutet dies, dass die Datentabelle so strukturiert sein muss, dass für jedes Gen der gleiche Kontrollpool referenziert werden muss. Außerdem wird es eine gewisse Normalisierung zwischen den Platten und zwischen den Läufen geben.
Vielleicht kann jemand in der Community oder in Ihrer Organisation Ratschläge geben, wie diese Daten normalisiert und strukturiert werden können, damit Sie entweder Fit Model oder Response Screening für Ihre Daten verwenden können. Das sind die beiden Plattformen, die ich in diesem Fall wahrscheinlich verwenden würde, um die Daten zu analysieren.
Es tut mir leid, dass ich Sie nicht zu den Feinheiten führen konnte, wie Sie an die Analyse herangehen würden.
Am besten,
Re: RNAi-ScreeningNur aus einer experimentellen Designperspektive möchte ich darauf eingehen, dass die ursprüngliche Frage lautete. Es hört sich so an, als ob Sie daran interessiert wären, zu bestimmen, wie ein Gen im Vergleich zu einer Kontrolle reagiert. Aber Sie haben mehrere Arten von Steuerelementen, und mir ist nicht klar, was das Ziel der einzelnen Steuerelemente war. Zum Beispiel könnte ich den wahren Durchschnitt der Negativkontrolle von der gesamten Platte subtrahieren, um den Hintergrund zu subtrahieren, dann könnte ich die Gene auf der Platte zu einem Haushaltsgen normalisieren, um festzustellen, ob das Signal des Gens relativ zu etwas hoch- oder herunterreguliert war konstitutiv ausgedrückt wird. Oder vielleicht auf ein Gen normalisieren, das maximal exprimiert wird...
Das zusätzliche Problem dabei ist, dass es so klingt, als hätte jede der 18 Platten einen völlig anderen Dynamikumfang. Und neben diesem Rauschen ist auch der Dynamikumfang über die wiederholten Experimente hinweg beachtlich.
Ein Ansatz, und ich bin sicher, dass es Kritiker geben wird, besteht darin, die Hintergrundsubtraktion und -normalisierung für jede Platte durchzuführen. Dann entweder die Antwort zentrieren und skalieren oder die Antwort auf 0-1 skalieren. Dies erzwingt, dass der Plattendynamikbereich für jede Platte identisch ist.
Nun, da wir dieses Problem in Angriff genommen haben, könnten wir, vorausgesetzt, es gibt noch etwas zu analysieren, die Genmittelwerte über die Platten in jedem experimentellen Replikat hinweg betrachten und dann den Durchschnitt der Gene aus den experimentellen Replikaten nehmen (ja, zweifaches Eintauchen auf die zentralen Grenzen). Satz und seine Legitimität.)
Es hört sich so an, als hätten Sie nur 3 oder 4 technische Replikate, daher ist die Schätzung von Sigma bei dieser Stichprobengröße ein wenig skizzenhaft, aber ich könnte mir den % CV ansehen und einen Schwellenwert festlegen, um festzustellen, ob die Daten für jedes Gen interpretierbar sind.
Zugegeben, all diese Ratschläge basieren darauf, dass Sie keine Ahnung haben, wie oder was Sie experimentell gemacht haben oder wie die tatsächlichen Daten auch nur vage aussehen. Dies könnte also hilfreich oder völlig nutzlos sein, aber hoffentlich ersteres.
-B
Re: RNAi-Screening
@Chris_Kirchberg schrieb:
Hallo @thestrider ,
Ich nehme an, dass die 400 Gene auch auf die 18 Platten verteilt sind, die in jedem Durchlauf verwendet werden? Wird jedes technische Replikat für jedes Gen auf einer anderen Platte platziert? Das bedeutet also entweder 11 oder 12 leere Kontrollen pro Platte und etwa 22 getestete einzelne Gene pro Platte. Ist das korrekt?
Der Ansatz, dies zu analysieren, hängt vom Design des Experiments und der Platzierung jedes technischen Replikats und den Genen auf den Platten sowie davon ab, wie die leeren (Mock-), Low- und High-Responder verwendet werden sollen. Davon hängt ab, wie die richtigen Variablen den richtigen Feldern in JMP zugewiesen werden (wie Fit Model, Fit Y by Y oder sogar Response Screening). Gleiches gilt für die Strukturierung der Datentabelle.
Sie sind nah dran, jede Platte hat 11-12 Kontrollen und ~80 Gene, die auf 5 verschiedene Mikrotiterplatten verteilt sind. Eine sechste Mikrotiterplatte sind nur Kontrollen, die über eine Platte verstreut sind. 3 Kopien jeder Platte wurden pro Lauf analysiert, insgesamt 18 Platten. Jedes technische Replikat für jedes Gen befindet sich somit auf 3 Platten. Die leeren Vektorkontrollen sind am wichtigsten, sie sollten verwendet werden, um die Varianz in meinen Experimenten zu bestimmen und eine Basislinien-Ansprechrate zu ermitteln.
Die Funktionsweise des Experiments - Tiere werden mit Bakterien gefüttert. Im leeren Vektor ist es das. Aber jedes Gen stellt einen Bakterienklon dar, der dieses spezifische Gen ausschaltet. Ich kann dann die Fluoreszenz eines Reporters messen, um festzustellen, wie sich das Abschalten dieses Gens auf einen Signalweg auswirkt.
Die High- und Low-Responder gibt es aus zwei Gründen: 1: Um festzustellen, dass das Experiment tatsächlich funktioniert, und 2: um eine ungefähre Vorstellung von der Reaktion zu bekommen, die wir von meinem Assay erwarten können. Die High- und Low-Responder sind die primären Inhibitoren und Aktivatoren des Genweges, den ich studiere, zumindest soweit mein Fachgebiet derzeit bekannt ist. Die anderen 400 Gene stehen im Verdacht, in einem früheren Experiment einen Einfluss auf diesen Signalweg zu haben.
Da die Kontrollen nicht genspezifisch sind, sondern ein Pool von Leer-/Mockvektorkontrollen, bedeutet dies, dass die Datentabelle so strukturiert sein muss, dass für jedes Gen der gleiche Kontrollpool referenziert werden muss. Außerdem wird es eine gewisse Normalisierung zwischen den Platten und zwischen den Läufen geben.
Richtig – die leeren Vektorkontrollen sind eine allgemeine Referenz für jedes Gen. Ich denke, eine Normalisierung zwischen den Läufen ist sehr notwendig. Zwischen den Platten könnte auch hilfreich sein, aber die Varianz ist dort nicht so groß, wie ich es sehe, zumindest wenn man grobe Durchschnitte verwendet. Wenn es eine Möglichkeit gibt, dies in jmp schnell zu überprüfen, würde ich gerne wissen, wie es geht.
