criblage de l'ARNiJe dispose d'un ensemble de données d'ARN interférent avec trois réplicats techniques, réalisés en triple. Par exemple :
Course 1
gène X 45
gène X 59
gène X 51
Contrôle 90
Course 2
gène X 145
gène X 159
gène X 151
Contrôle 190
Course 3
gène X 35
gène X 39
gène X 31
Contrôle 50
L'ensemble de données réel contient des centaines de gènes et des dizaines de témoins par expérience. La moyenne de chaque série a tendance à varier, mais les expériences étaient identiques. Je pense que cela est dû à l'humidité ambiante, mais cela n'a finalement pas d'importance. Ce qui m'intéresse, ce sont les gènes, et non la variation entre les séries. Je souhaite essentiellement identifier les gènes qui diffèrent du témoin, et obtenir une probabilité (valeur p ?). Quelle est la meilleure approche pour analyser ces données avec JMP ?
Ingénierie de la qualité et des procédésRe: Dépistage ARNisalut @thestrider
Je serais ravi de vous accompagner dans cette démarche.
J'ai quelques questions de clarification/vérification puisque ma réponse finale dépendra de ces réponses.
- Alors, votre tableau de données ressemble-t-il à quelque chose comme ça mais avec de nombreux gènes ?
- Y a-t-il un seul contrôle par série mais trois mesures techniques de la même condition dans la même série (comme dans le tableau ci-dessus) ?
- Avez-vous quelque chose comme la condition x est une condition expérimentale, avec trois répétitions techniques pour le gène x, et vous avez plusieurs conditions pour l'expérience (condition x, y, z, etc.) ?
- Autant de détails que vous pouvez donner, plus ma réponse/solution sera précise et appropriée.Même à quoi ressemble la sortie de vos données aide.
Merci,
Re: Dépistage ARNiSalut chris!
Vous avez raison, mon ensemble de données ressemble presque exactement à votre image, avec 400 gènes (gène x, y, z, etc.) et quelques métadonnées supplémentaires juste pour la validation. (c'est-à-dire emplacement de la microplaque à 96 puits, nom de la plaque, etc.)
Chaque série comporte de nombreux contrôles, certains sont des vecteurs vides (ligne de base, aucun effet) d'autres sont des gènes connus qui génèrent des réponses élevées ou faibles. Chaque microplaque avait des contrôles, et nous venons également de tester une microplaque de contrôle uniquement dans chacune des trois séries. Environ 15 % de mon ensemble de données (environ 2 000 mesures sur 15 000) sont des contrôles.
- Avez-vous quelque chose comme la condition x est une condition expérimentale, avec trois répétitions techniques pour le gène x, et vous avez de nombreuses conditions pour l'expérience (condition x, y, z, etc.)
Je pense que c'est une bonne façon de le décrire. Chaque gène de la liste est un gène qui a été désactivé. J'ai donc désactivé 400 gènes, un à la fois. Dans chaque série, j'avais trois copies identiques de chaque microplaque, il y a donc 3 répliques techniques de chaque gène. Je dois noter ici qu'environ 15% des données ont été censurées au hasard (les bactéries ne se sont pas développées, contaminées, etc.), donc parfois les gènes n'ont pas 3 réplicats techniques. J'ai ensuite répété toute cette expérience de la même manière deux fois de plus. Donc, dans un monde idéal, j'ai 9 points de données par condition. La censure est aléatoire, donc certains gènes n'ont que 4 à 5 points de données.
La moyenne de contrôle du vecteur vide varie dans les trois expériences. Mais la réponse de chaque gène devrait être similaire. Ainsi, un gène qui abaisse la valeur par rapport à la ligne de base devrait toujours l'abaisser, mais les chiffres eux-mêmes varient parfois considérablement dans les trois séries.Ainsi, le gène X pourrait avoir une valeur de 70 par rapport à une ligne de base moyenne de 100 dans une exécution, mais une valeur de 120 contre une ligne de base de 300 dans la suivante. J'ai pensé que j'aurais peut-être besoin de normaliser, mais je crains que les données ne soient tronquées et je ne suis pas sûr des statistiques pour le faire. Je mesure des niveaux de fluorescence, et fondamentalement, les choses sombres ne deviennent pas beaucoup plus sombres, mais les choses lumineuses peuvent devenir très lumineuses. Donc, par queue, je veux dire dans l'exemple que je viens de donner, un gène brillant peut être une ligne de base de 350 contre 100, mais lors de la prochaine exécution, il pourrait être de 1200 contre 300 de base. En d'autres termes, il y a une grande plage numérique sur l'extrémité supérieure de l'échelle, mais la plage inférieure est plus petite. J'espère que cela à du sens.
J'ai joint un petit powerpoint, il montre ce que je mesure, ( nématodes c. elegans) et un échantillon de données.
Re: Dépistage ARNiMerci @thestrider ,
Oui, il y a plusieurs choses qui doivent être abordées ici. Je ne peux pas vous dire ce que vous devriez faire statistiquement (quelle analyse vous auriez besoin de faire ou comment traiter la variabilité entre les séries due à des facteurs externes, comme le décalage des valeurs de contrôle et de traitement) car il nous est conseillé de ne pas donner de conseils statistiques sur la façon de traiter chacun de ces problèmes, mais je peux vous indiquer les plates-formes au sein de JMP qui pourraient aider à résoudre certains d'entre eux
Les comparaisons statistiques intra-séries ne peuvent pas être effectuées car il n'y a qu'un seul contrôle par cycle et aucun moyen d'évaluer la variabilité de la variation intra-série pour faire cette comparaison (du moins pas par les méthodes statistiques traditionnelles dont je suis au courant).La variation entre les séries peut être estimée puisqu'il y a trois contrôles, mais elle sera biaisée car vous pouvez avoir jusqu'à 9 mesures possibles pour la condition d'intérêt.Cela serait considéré comme déséquilibré et vous donnerait peut-être une variance inégale.Heureusement, JMP dispose d'un moyen de gérer la variance inégale dans la plate-forme Fit Y by X (réponse du gène X dans la section Y, Response et condition dans la section X, Factor).Ensuite, choisissez t-Test dans le triangle rouge qui vous donnera les moyennes pour chaque groupe et une valeur p pour tester si la condition est différente du contrôle, en supposant une variance inégale. Les données censurées sont essentiellement des données manquantes (non mesurables pour la raison donnée) et il est logique que vous ayez ajouté des réplicats techniques pour répondre à ces problèmes pour chaque exécution.
De plus, comme vous l'avez mentionné, les valeurs changent d'une exécution à l'autre, y compris le contrôle, presque comme une situation de paire de correspondance (ou une situation de type test t apparié) ou un effet de lot. Ainsi, ce qui précède ne suffit pas à lui seul pour voir s'il existe une différence statistique en raison de ce biais supplémentaire. Il pourrait y avoir plusieurs façons de résoudre ce problème. L'une peut consister à effectuer une régression multiple où l'exécution et la condition sont des effets (un peu comme le lot et la condition à la recherche d'effets de lot et à leur adaptation).
Dans ce cas, Fit Model est la plate-forme à utiliser et le choix des moindres carrés standard car la personnalité vous conduira au type de test/d'analyse qui pourrait être le plus approprié dans votre cas. Je voudrais d'abord tester pour voir s'il y a un effet d'exécution en mettant l'exécution, la condition et l'interaction de l'exécution et de la condition comme effets de modèle, puis la réponse Gene X comme Y.Vous pouvez le faire pour tous les gènes (et ce serait beaucoup à regarder pour des centaines de gènes). Le petit exemple de données que vous avez, je l'ai fait et il y a certainement un effet dû à la variabilité d'une exécution à l'autre, ce qui signifie qu'il doit être pris en compte dans les tests statistiques que vous effectuez.
J'ai créé un tableau JMP et enregistré les analyses Fit Y by X et Fit Model dans le tableau de données afin que vous puissiez voir comment j'ai effectué chaque test. Il est joint à ce post.
Il est préférable de contacter un statisticien en interne ou de voir si l'un de nos aimables membres de la communauté est prêt à vous conseiller sur la meilleure façon de traiter votre situation. Peut-être aussi prendre le gratuit Pensée statistique pour la résolution de problèmes industriels Le cours pourrait aider à en savoir plus sur les statistiques qui pourraient aider dans cette situation.Ou jetez un œil au Portail de connaissances statistiques pour plus de compétences statistiques.
Désolé, je ne suis pas en mesure de donner les conseils statistiques dont vous pourriez avoir besoin, mais j'espère avoir au moins indiqué où dans JMP vous pourriez analyser vos données et évaluer l'expérience et tester la signification des conditions.
Meilleur,
Re: Dépistage ARNi
@Chris_Kirchberg a écrit:
Les comparaisons statistiques intra-séries ne peuvent pas être effectuées car il n'y a qu'un seul contrôle par cycle et aucun moyen d'évaluer la variabilité de la variation intra-série pour faire cette comparaison
Salut Chris, merci beaucoup pour ce qui est incroyablement utile. Je suis un peu confus par cette partie, désolé je n'étais pas clair, mais j'ai ~ 210 points de données de contrôle vectoriel vides pour chacune de mes trois courses. Ils sont répartis sur toutes les microplaques que j'ai faites (18 plaques par série) mais sont identiques par ailleurs.J'ai également un nombre similaire de contrôles utilisant des répondeurs haut et bas connus.
Re: Dépistage ARNisalut @thestrider ,
Merci pour la clarification. Je pensais que vous n'aviez qu'une mesure de contrôle par gène et par run.Cela a plus de sens maintenant.
Je suppose que les 400 gènes sont également répartis sur les 18 plaques utilisées dans chaque cycle ? Chaque réplicat technique de chaque gène est-il placé sur une plaque différente ? Cela signifie donc 11 ou 12 contrôles vides par plaque et environ 22 gènes individuels testés par plaque. Est-ce exact?
L'approche pour analyser cela dépend de la conception de l'expérience et du placement de chaque réplicat technique et des gènes à travers les plaques ainsi que de la façon dont les répondeurs vides (simulés), faibles et élevés doivent être utilisés. La manière d'affecter les bonnes variables aux bons champs dans JMP (comme Fit Model, Fit Y by Y ou même Response Screening) dépendra de cela. Idem pour la structure de la table de données.
Étant donné que les contrôles ne sont pas spécifiques d'un gène, mais qu'il s'agit d'un pool de contrôles vectoriels vides/fictifs, cela signifie que le tableau de données doit être structuré de telle sorte que le même pool de contrôles doit être une référence pour chaque gène. De plus, il va y avoir une certaine normalisation entre les plaques et entre les passages.
Peut-être qu'un membre de la communauté ou de votre organisation peut vous conseiller sur la façon de normaliser ces données et de les structurer de sorte que l'on puisse utiliser soit le modèle d'ajustement, soit le filtrage des réponses pour vos données. Ce sont les deux plates-formes que j'utiliserais probablement pour analyser les données dans ce cas.
Désolé, je n'ai pas pu vous guider vers les détails les plus fins de la façon dont vous aborderiez l'analyse.
Meilleur,
Re: Dépistage ARNiDu point de vue de la conception expérimentale, j'aimerais en venir à la question initiale. Il semble que vous souhaitiez déterminer comment un gène réagit par rapport à un contrôle. Mais vous avez plusieurs types de contrôles, et je ne sais pas quel était l'objectif de chaque contrôle. Par exemple, je pourrais soustraire la vraie moyenne de contrôle négatif de toute la plaque, pour soustraire le fond, puis je pourrais normaliser les gènes sur la plaque à un gène domestique pour déterminer si le signal du gène était régulé à la hausse ou à la baisse par rapport à quelque chose qui est exprimé constitutivement. Ou peut-être normaliser à un gène qui est exprimé au maximum...
Le problème supplémentaire ici est qu'il semble que chacune des 18 plaques ait une plage dynamique très différente. Et en plus de ce bruit, la plage dynamique à travers les expériences répétées est également considérable.
Une approche, et je suis sûr qu'il y aura des critiques, consiste à effectuer une soustraction et une normalisation de fond pour chaque plaque, puis soit centrer et mettre à l'échelle la réponse, soit mettre la réponse à l'échelle de 0-1. Cela force la plage dynamique de la plaque à être identique pour chaque plaque.
Maintenant que nous avons résolu ce problème, en supposant qu'il y ait encore quelque chose à analyser, nous pourrions examiner les moyennes des gènes à travers les plaques dans chaque réplicat expérimental, puis prendre la moyenne des gènes des réplicats expérimentaux (oui, double trempage sur les limites centrales théorème, et sa légitimité.)
Il semble que vous n'ayez que 3 ou 4 répétitions techniques, donc l'estimation de sigma est un peu sommaire avec cette taille d'échantillon, mais je pourrais regarder le % CV et définir un seuil pour déterminer si les données pour chaque gène sont interprétables.
Certes, tous ces conseils sont basés sur le fait de n'avoir aucune idée de comment ou de ce que vous avez fait expérimentalement ou même à quoi ressemblent les données réelles, même vaguement. Donc, cela pourrait être utile, ou complètement inutile, mais j'espère que le premier.
-B
Re: Dépistage ARNi
@Chris_Kirchberg a écrit:
salut @thestrider ,
Je suppose que les 400 gènes sont également répartis sur les 18 plaques utilisées dans chaque cycle ? Chaque réplicat technique de chaque gène est-il placé sur une plaque différente ? Cela signifie donc 11 ou 12 contrôles vides par plaque et environ 22 gènes individuels testés par plaque. Est-ce exact?
L'approche pour analyser cela dépend de la conception de l'expérience et du placement de chaque réplicat technique et des gènes à travers les plaques ainsi que de la façon dont les répondeurs vides (simulés), faibles et élevés doivent être utilisés. La manière d'affecter les bonnes variables aux bons champs dans JMP (comme Fit Model, Fit Y by Y ou même Response Screening) dépendra de cela. Idem pour la structure de la table de données.
Vous êtes proche, chaque plaque comporte 11 à 12 contrôles et environ 80 gènes répartis sur 5 microplaques différentes. Une sixième microplaque est juste des contrôles dispersés sur une plaque. 3 copies de chaque plaque ont été analysées par série, pour un total de 18 plaques. Chaque réplicat technique pour chaque gène est ainsi sur 3 plaques. Les contrôles vectoriels vides sont les plus importants, ils devaient être utilisés pour déterminer la variance dans mes expériences et établir un taux de réponse de base.
La façon dont fonctionne l'expérience - les animaux sont nourris avec une bactérie. En vecteur vide, c'est tout. Mais chaque gène représente un clone bactérien qui désactive ce gène spécifique. Je peux ensuite mesurer la fluorescence d'un reporter pour déterminer comment la désactivation de ce gène affecte une voie.
Les réponses hautes et basses sont là pour deux raisons : 1 : Pour établir que l'expérience fonctionne réellement et 2 : pour avoir une idée approximative du niveau de réponse que nous pouvons attendre de mon test. Les répondeurs élevés et faibles sont les principaux inhibiteurs et activateurs de la voie génique que j'étudie, du moins pour autant que mon domaine le sache actuellement. Les 400 autres gènes sont suspectés d'avoir un effet sur cette voie dans une expérience antérieure.
Étant donné que les contrôles ne sont pas spécifiques d'un gène, mais qu'il s'agit d'un pool de contrôles vectoriels vides/fictifs, cela signifie que le tableau de données doit être structuré de telle sorte que le même pool de contrôles doit être une référence pour chaque gène. De plus, il va y avoir une certaine normalisation entre les plaques et entre les passages.
Correct - les contrôles vectoriels vides sont une référence générale pour chaque gène. Je pense que la normalisation entre les courses est très nécessaire. Entre les assiettes pourrait également être utile, mais la variance n'est pas aussi importante que ce que je vois, du moins en utilisant des moyennes approximatives. S'il existe un moyen de vérifier cela rapidement dans jmp, j'aimerais savoir comment le faire.
Ré: Criblage de l'ARN interférentTout d'abord, merci beaucoup pour toutes les réponses, je suis un peu impressionné par toute l'aide que je reçois de cette communauté, c'est incroyable.
@Byron_JMP a écrit :
D'un point de vue purement expérimental, j'aimerais revenir à la question initiale. Il semble que vous souhaitiez déterminer comment un gène réagit par rapport à un témoin. Mais vous avez plusieurs types de témoins, et je ne sais pas exactement quel était l'objectif de chaque témoin. Par exemple, je pourrais soustraire la moyenne du témoin négatif réel de la plaque entière, pour soustraire le bruit de fond, puis je pourrais normaliser les gènes de la plaque par rapport à un gène de contrôle pour déterminer si le signal du gène était régulé à la hausse ou à la baisse par rapport à quelque chose qui est exprimé de manière constitutive. Ou peut-être normaliser par rapport à un gène qui est exprimé au maximum...
L'objectif était de découvrir des gènes qui ont un effet sur une voie en utilisant un rapporteur fluorescent. Le vecteur vide est ma ligne de base, il montre ce qui se passe lorsque je ne fais rien. Donc à peu près analogue à l'utilisation d'un gène de ménage. Le positif et le négatif sont juste là pour voir si mon interférence ARN fonctionne (induisant la suppression d'un gène spécifique) et pour avoir une idée approximative de la plage de fluorescence dans mon test. Comment effectuer la normalisation sur le vecteur vide en utilisant JMP ? C'est quelque chose que j'ai également pensé être utile et je suis heureux d'entendre que vous pensez de la même manière.
Le problème supplémentaire ici est qu'il semble que chacune des 18 plaques ait une plage dynamique très différente. Et en plus de ce bruit, la plage dynamique des expériences répétées est également considérable.
Remarque : les 18 plaques d'une série n'ont pas de plage dynamique très différente. Elle semble raisonnable entre les plaques, et je ne vois pas non plus beaucoup de différence en fonction de l'emplacement des plaques. Le changement radical de plage dynamique est vraiment visible lorsque j'ai reproduit l'expérience deux fois (j'ai 54 plaques de données). Les répliques étaient censées être identiques, mais je pense qu'il y avait une journée humide. Mon reporter est sensible à l'oxygène...
Une approche, et je suis sûr qu'il y aura des critiques, consiste à effectuer une soustraction et une normalisation de l'arrière-plan pour chaque plaque, puis soit à centrer et à mettre à l'échelle la réponse, soit à mettre à l'échelle la réponse à 0-1. Cela force la plage dynamique de la plaque à être identique pour chaque plaque.
Maintenant que nous avons résolu ce problème, en supposant qu'il y ait encore quelque chose à analyser, nous pourrions examiner les moyennes des gènes sur les plaques dans chaque réplique expérimentale, puis prendre la moyenne des gènes des répliques expérimentales (oui, double emploi avec le théorème des limites centrales, et c'est légitime.)
Cela semble intéressant, comment le ferais-je dans jmp ?
Il semble que vous n'ayez que 3 ou 4 répliques techniques, donc l'estimation du sigma est un peu approximative avec cette taille d'échantillon, mais je pourrais regarder le %CV et définir un seuil pour déterminer si les données de chaque gène sont interprétables.
J'ai jusqu'à 9 points de données, 1 point provenant de 3 microplaques (répliques techniques) chacune de trois journées d'expérience identiques. (répliques biologiques) Pour ce type de criblage, dans mon domaine, il existe des articles publiés sans répliques. J'espérais qu'en générant au moins quelques répliques, je pourrais détecter les répondeurs les plus faibles dans mon ensemble de données. Comment puis-je définir un seuil dans jmp ?
merci, c'est vraiment très utile !
Objet : Criblage par ARN interférentSalut @thestrider ,
Les outils JMP dont vous aurez probablement besoin sont les formules de colonnes (pour créer des données normalisées à analyser) et le modèle d'ajustement (modèle standard des moindres carrés où vous définissez votre réponse et les effets du modèle, les variables aléatoires, les interactions, etc.). La manière dont vous créerez une formule de normalisation des données et les effets du modèle nécessaires à votre expérience dépendront de vous (vos connaissances en statistiques et en conception expérimentale).
Voici un lien vers une recherche concernant l'analyse des données de plaques 96 puits et la conception d'expériences pour ces formats sur ce site communautaire. Consultez-le ; il devrait vous aider à analyser votre type de données selon le format.
Il existe également des liens vers la documentation de JMP sur la création de formules de colonnes et l'ajustement du modèle à l'aide des moindres carrés standard .
J’espère que cela vous aidera à déterminer où dans JMP effectuer ces tâches.
Acclamations,
