RNAseq 資料的廣義線性模型或名目 Logistic同事，
想像一下，我有在一次定序實驗中在 2 個環境中測量的讀數計數形式的 RNAseq 數據，每個環境有 3 個重複。 像這樣：
環境讀取
一 9
一 10
一 11
乙4
乙5
乙6
當然，我可以將每個讀取計數視為一個自變數並在測試時執行，我的功效將非常低。 相反，我希望能夠將每次讀取視為一次觀察，然後注意到在一次給定的測序工作中，我在來自環境B 的樣本中獲得了15 個讀取，但在來自環境A 的樣本中獲得了30 個讀取。 這不太可能是偶然觀察到的，與 t 檢定不同，我檢測環境 A 和 B 之間差異的能力要高得多，並且會隨著定序工作的進行而增加。 （在典型的 RAseq 實驗中，讀數數量要高得多，對於某些基因來說，每個樣本通常有數百個讀數；2 倍計數差異將非常顯著）。
我希望能夠使用更複雜的模型進行應急測試，也許使用 3 個不同的自變數（並作為區塊效應進行複製）。
簡單的解決方案是這樣的：我創建一個額外的分類變量，我們將其稱為“模型”，其值為“觀察到”和“預期”，“觀察到”對應於上面的行，“預期”對應於相同數量的行，但具有以下列：如果沒有顯著影響，則包含預期計數的讀取，即，在這種情況下，平均讀取計數（假設每個重複中的工作量相等）。
然後運行這個：
擬合模型( Freq( :reads ), Y( :Model ), 效果( :Env, :rep ), 個性( 名義Logistic ), 運行( 似然比檢定( 1 ), Wald 檢定( 0 ) ) )
……或這個（這給了我相同的結果，我不太明白為什麼，但我對此感到滿意）：
擬合模型( Freq( :reads ), Y( :Model ), 效果( :Env, :rep ), 個性( 廣義線性模型), GLM 分佈( 二項式), 連結函數( Logit ), 過度離散檢定和區間( 0 ) , 名稱(“Firth 偏差調整估計值”)(0), 運行 )
我是否做了一些可笑的錯誤，或者這作為一個有效的測試是否有意義？
如果有意義，是否有一種方法可以實現相同的目的，而無需建立具有預期計數的額外行？
提前致謝！！
揚波爾斯基
數據探索和視覺化品質和工藝工程回覆：RNAseq 資料的廣義線性模型或名目 Logistic謝謝，這很有幫助，現在更有意義了。我會看一下（我希望還有其他人）對該方法進行健全性檢查。
回覆：RNAseq 資料的廣義線性模型或名目 Logistic@l_yampolsky謝謝你的提問。當將響應從二項式轉換為二項式時，廣義線性混合模型中也會出現同樣的問題。在這種情況下，必須聲明原始樣本是隨機效應，否則結果會完全誤導。
不幸的是，您的第二次分析也是如此，因為您實際上假設每個觀察值都是獨立的，而實際上它們是根據原始樣本進行聚類的。要修正第二個分析，請將代表效應宣告為隨機，如果您有 JMP Pro 並使反應連續（我建議對其進行 log2 轉換），您還需要將個性更改為標準最小二乘法或混合模型。或者，如果您想保留泊松響應，Meichen Dong 有一個 GLMM 插件，可以從社區下載，她甚至在文檔中提供了一個 RNASeq 範例：廣義線性混合模型插件
底線是，你實際上只有 16 個犯錯的自由度，你無法欺騙它。
您對 6K 轉錄本的多次測試的擔憂是正確的。如果某些轉錄本是已知的並預先指定，您可以將單一轉錄本分析顯示為第一個或修改後的第二個。對於全套，製作一個火山圖，看看你有什麼。另一個想法是建立一個或多個基因或路徑評分（對相關轉錄本進行平均）並進行分析。
回覆：RNAseq 資料的廣義線性模型或名目 Logistic我在上面的線程中發布了一個示例。
預先感謝您的寶貴意見！
揚波爾斯基
回覆：RNAseq 資料的廣義線性模型或名目 Logistic這是一個例子：
具有標稱響應範例的廣義線性模型
資料檔：Example1Fp52.43_cH8.jmp
研究了人類粒線體載體蛋白 Aralar1 的甲殼類同源物在 4 個克隆中的表達水蚤暴露於急性缺氧（3次缺氧和3次對照重複）。 4 個克隆 x 2 次處理 x 3 個重複 = 24 行。
首先，使用 RPKM 作為反應變量，缺氧和克隆作為因子進行 2 路方差分析：
適合模型(
Y（：RPKM），
效果（：克隆，：急性缺氧，：克隆*：急性缺氧），
個性（標準最小平方法），
強調（最少報告），
跑步（
:RPKM << {缺乏擬合( 0 )，根據預測繪製實際值( 0 )，
繪製迴歸 ( 0 )，繪製預測殘差 ( 0 )，
情節效果槓桿( 0 )}
）
）
結果是：
響應RPKM
效果測試
源 Nparm DF 平方和 F 比 Prob > F
克隆 3 3 10222.900 3.6649 0.0349
急性缺氧 1 1 42430.209 45.6339 <.0001
克隆*急性缺氧 3 3 12083.132 4.3318 0.0205
好吧，事情很重要，但克隆和相互作用的影響將永遠無法在任何類型的多重測試校正中倖存（這只是 RNAseq 數據中約 6K 轉錄本的一個例子）。
然後，使用包含預期讀取數的讀取列創建 24 個虛擬行，以防沒有克隆或缺氧的影響，並且在每種克隆/缺氧組合中的 3 個重複之間也沒有差異 - 即，實際24行。 虛擬行在 :ObsExp 欄位中標記為“Exp”，原始實際觀測值標記為“Obs”。 現在我們想知道 Obs 是否與 Exp 不同，如果是，則由於哪些自變數而不同。 為了實現這一點，我運行（觀察比現在原始：讀取，而不是 RPKM 用作頻率：
適合模型(
頻率（：讀取），
Y（：觀測值），
效果（
:複製,
：急性缺氧，
：急性缺氧*：克隆，
：代表[：克隆，：急性缺氧]
),
個性（名義邏輯），
Run( 似然比檢定 ( 1 ), Wald 檢定 ( 0 ) ),
SendToReport( Dispatch( {}, "參數估計", OutlineBox, {Close( 1 )} ) )
）
正如預期的那樣，其結果是更強大：
效應似然比檢定
來源 Nparm DF LR 卡方 Prob>ChiSq
克隆 3 3 208.563245 <.0001
急性缺氧 1 1 114.216936 <.0001
急性缺氧*克隆 3 3 54.2042677 <.0001
代表[克隆，急性缺氧] 16 16 92.4764669 <.0001
注意：使用以下方法可以獲得完全相同的結果：
人格（廣義線性模型），
GLM 分佈（二項式），
連結函數（Logit）
回覆：RNAseq 資料的廣義線性模型或名目 Logistic感謝您的回答。
我認為你無法迴避進行類似 t 檢定的分析。 重複是變異性估計和執行分析的自由度的來源，不需要嵌套。 JMP 術語中的嵌套如下：
如果一種效應 (B) 的水平僅出現在另一種效應 (A) 的單一水平內，則稱 B 為嵌套的在 A (B[A]) 內。
這表示您必須有一個因素 (B)，使得 B 等級的某個等級只能套用於 Env 的某個等級內。 所以。因子 B 的等級 1 和 2 僅出現在 Env A 中，因數 B 的 3 和 4 級僅出現在 Env 中。 B. 如果 Env 是模型效應，則表示重複位於 Env 的關聯水準內。 因此無需將它們明確分配到每個 Env 層級。
JMP 會讓你這樣做，但我不認為它在統計上有效或有意義。
此外，也沒有必要將重複放入隨機樣本，因為這也是暗示的（三個重複應該是隨機樣本，並且在廣義線性模型或廣義迴歸中是不允許的）。
在這種情況下，Reads 是 Y，我認為 Freq 選項不會執行您期望的操作（通常避免該選項）。 泊松分佈將是使用廣義線性模型或負二項式或泊松進行廣義迴歸 (JMP Pro) 的分佈。
我想你需要為數千個基因做這件事？
感謝您發送範例表。 我創建了一個表，其中包含已儲存的分析腳本，以便我們繼續討論。 我建立了一個附加列（複製和複製 ID）供本次討論使用。
回覆：RNAseq 資料的廣義線性模型或名目 Logistic複製品來自不同的個體；生物複製。 你是絕對正確的，將它們集中起來並不是一個好主意。 然而，我可以將複製作為隨機自變量納入我的模型中，嵌套在環境處理中，本質上將此設計視為區塊設計 - 相同的實驗重複 3 次。
我更擔心一般方法 - 在零假設下創建具有預期“計數”的虛擬觀察（即，各處的讀取計數相等），並使用列聯表/名義物流模型來查看實際計數是否不同。
我將按照另一位用戶的建議，發布一個包含實際數據的範例。
回覆：RNAseq 資料的廣義線性模型或名目 Logistic你好@l_yampolsky ,
需要明確的是，對於每個環境，您都有三個樣本（重複）。 但是，您不想組合每個環境的重複項並進行類似 t 檢定的分析，而是希望將每個樣本視為計數代表該樣本轉錄本群體中特定轉錄本（轉錄本 A）的觀察數量。 來自同一環境的下一個樣本就像從同一轉錄本群體中提取一組新的觀察結果，並觀察有多少屬於相同的轉錄本 A。 我理解正確嗎？
問題：每個樣本是來自同一個體（即該個體內細胞群體的樣本，因此技術重複）還是來自同一環境中的不同個體（即每個個體的樣本，因此代表樣本的不同群體）經歷過相同環境的細胞）？
如果樣本來自不同的個體，我認為這不是有效的方法。 計數是對環境某些變化的反應。 這就像在測試環境中計算來自光源的特定波長的光子數量，然後將其與來自另一個具有相似光源且也在相同環境中的不同設備的相同波長的光子數量進行匯總。 它們不是同一光源（或設備），而是同一光源的代表，必須相互獨立對待。 這將代表設備之間的差異，並且必須單獨跟踪，因為每個設備都不是另一個設備的精確副本。 如果是的話，那麼測試就不需要多個設備，因為所有光子都來自單一來源，並且每個樣本都將是該來源的代表性樣本。
RNAseq 的相似之處在於它是對樣本中的實體或轉錄本的豐度進行定量的努力。 下一個樣本通常不是來自同一來源總體的樣本。 它通常是來自不同個體的樣本，因此必須以這種方式處理。 個體與個體之間存在差異。 即使來自同一個體的相同組織的樣本也具有變異性（細胞處於不同的分裂狀態、功能分層等），並且不應將它們匯集在一起，就好像它們來自同一細胞群一樣。
最終，這一切實際上取決於所提出的科學問題以及用於發現該問題答案的實驗設計。 您也許可以將它們集中起來，做您想做的事，也可能不做。 這取決於....
回覆：RNAseq 資料的廣義線性模型或名目 Logistic如果您附上包含不同分析的範例資料表，可能會有所幫助。 我發現這比嘗試從文字描述中想像資料表更容易理解。
