RNAseq 데이터에 대한 일반화 선형 모델 또는 명목 로지스틱동료,
단일 시퀀싱 실험에서 각각 3번씩 반복하여 2가지 환경에서 측정된 읽기 수 형태의 RNAseq 데이터가 있다고 상상해 보세요. 이와 같이:
환경 읽기
에이 9
10
에이 11
비 4
비5
비 6
물론 각 읽기 수를 독립 변수로 처리하고 테스트할 수 있으며 전력은 매우 낮습니다. 대신, 각 읽기를 관찰로 처리한 다음 단일 시퀀싱 노력으로 환경 B의 샘플에서는 15개의 읽기를 얻었지만 환경 A의 샘플에서는 30개의 읽기를 얻었음을 확인할 수 있기를 원합니다. 이것은 우연히 관찰될 가능성이 거의 없으며 환경 A와 B 사이의 차이를 감지하는 나의 능력은 훨씬 더 높으며 t-테스트와 달리 시퀀싱 노력에 따라 증가할 것입니다. (일반적인 RAseq 실험에서는 판독 횟수가 훨씬 더 높으며, 일부 유전자의 경우 샘플당 수백 개가 되는 경우가 많습니다. 2배 수의 차이는 매우 중요합니다.)
나는 3개의 서로 다른 독립 변수(그리고 블록 효과로 복제)를 사용하여 보다 복잡한 모델을 사용하여 이 비상 테스트를 수행할 수 있기를 원합니다.
쉬운 해결책은 다음과 같습니다. 추가 범주형 변수를 만들고 Observed 및 Expected 값을 사용하여 "Model"이라고 부르겠습니다. "Observed"는 위 줄에 해당하고 "Expected"는 같은 수의 줄에 있지만 열은 다음과 같습니다. 효과가 중요하지 않은 경우 예상 카운트가 포함된 읽기, 즉 이 경우 평균 읽기 카운트(각 반복에서 동일한 노력을 가정).
그런 다음 다음을 실행하십시오.
적합 모형( Freq( :reads ), Y( :Model ), 효과( :Env, :rep ), 성격( 명목 로지스틱 ), 실행( 우도비 검정( 1 ), Wald 검정( 0 ) ) )
...또는 다음과 같습니다(동일한 결과를 제공하는데 이유는 잘 모르겠지만 만족합니다).
적합 모형( Freq( :reads ), Y( :Model ), 효과( :Env, :rep ), 성격( 일반화 선형 모형 ), GLM 분포( 이항 ), 연결 함수( Logit ), 과분산 검정 및 간격( 0 ) , Name( "Firth Bias-adjusted Estimates" )(0), Run )
제가 뭔가 터무니없게 잘못된 일을 하고 있는 걸까요, 아니면 이것이 유효한 테스트로서 의미가 있는 걸까요?
타당하다면 예상 개수를 사용하여 추가 라인을 만들 필요 없이 동일한 결과를 얻을 수 있는 방법이 있을까요?
미리 감사드립니다!!
L.얌폴스키
데이터 탐색 및 시각화품질 및 프로세스 엔지니어링답: RNAseq 데이터에 대한 일반화 선형 모델 또는 명목 로지스틱감사합니다. 많은 도움이 되었으며 이제는 좀 더 이해가 가네요.나는 접근 방식의 온전성 검사를 수행하기 위해 (다른 사람들도 마찬가지로) 살펴보겠습니다.
답: RNAseq 데이터에 대한 일반화 선형 모델 또는 명목 로지스틱@l_yampolsky 질문해주셔서 감사합니다.이와 동일한 문제는 반응을 이항에서 이항으로 변환할 때 일반화 선형 혼합 모형에서 발생합니다.그러한 상황에서는 원본 표본을 무작위 효과로 선언하는 것이 필수적입니다. 그렇지 않으면 결과가 완전히 오해될 수 있습니다.
불행하게도 이것은 두 번째 분석의 경우에도 마찬가지입니다. 실제로는 원래 샘플별로 클러스터링되어 있지만 모든 관찰이 독립적이라고 효과적으로 가정하기 때문입니다.두 번째 분석을 수정하려면 반복 효과를 무작위로 선언하고 JMP Pro가 있는 경우 특성을 표준 최소 제곱 또는 혼합 모델로 변경하고 응답을 연속적으로 만들어야 합니다(log2 변환을 제안합니다).또는 Meichen Dong은 Poisson 응답을 유지하려는 경우 커뮤니티의 여기에서 다운로드할 수 있는 GLMM용 추가 기능을 가지고 있으며 문서에 RNASeq 예제도 있습니다. 일반화 선형 혼합 모델 추가 기능
결론적으로, 오류에 대한 자유도는 16도에 불과하며 속일 수 없습니다.
6K 성적표에 대한 여러 테스트에 대해 우려하는 것이 맞습니다.특정 성적표가 알려져 있고 미리 지정된 경우 잠재적으로 단일 성적표 분석을 첫 번째 또는 수정된 두 번째 분석으로 표시할 수 있습니다.전체 세트의 경우 화산 플롯을 만들고 무엇을 얻었는지 확인하십시오.또 다른 아이디어는 하나 이상의 유전자 또는 경로 점수(관련 전사체에 대한 평균)를 구성하고 이를 분석하는 것입니다.
답: RNAseq 데이터에 대한 일반화 선형 모델 또는 명목 로지스틱위 스레드에 예시를 게시했습니다.
귀하의 소중한 의견에 미리 감사드립니다!
L.얌폴스키
답: RNAseq 데이터에 대한 일반화 선형 모델 또는 명목 로지스틱예는 다음과 같습니다.
명목형 응답 예제를 사용한 일반화 선형 모형
데이터 파일: example1Fp52.43_cH8.jmp
인간 미토콘드리아 운반 단백질 Aralar1의 갑각류 동족체 발현이 4개의 갑각류 클론에서 연구되었습니다. 물벼룩 급성 저산소증에 노출됨(3회 저산소증 및 3회 대조군 반복). 4개 클론 x 2개 처리 x 3개 반복 = 24개 행.
먼저, RPKM을 반응 변수로 사용하고 저산소증과 클론을 요인으로 사용하여 양방향 분석을 수행했습니다.
적합모델(
Y( :RPKM ),
효과( :클론, :급성저산소증, :클론 * :급성저산소증),
성격(표준 최소 제곱),
강조(최소보고),
달리다(
:RPKM << {적합성 부족( 0 ), 예측에 따른 실제 플롯( 0 ),
회귀 플롯( 0 ), 예측별 잔차 플롯( 0 ),
플롯 효과 활용( 0 )}
)
)
결과는 다음과 같습니다.
응답RPKM
효과 테스트
소스 Nparm DF 제곱합 F 비율 확률 > F
클론 3 3 10222.900 3.6649 0.0349
급성저산소증 1 1 42430.209 45.6339 <.0001
클론*급성저산소증 3 3 12083.132 4.3318 0.0205
좋아, 모든 것이 중요하지만 클론의 효과와 상호 작용은 어떤 종류의 다중 테스트 수정에서도 살아남지 못할 것입니다(이것은 RNAseq 데이터에 있는 ~6K 전사체의 한 예일 뿐입니다).
그런 다음 클론 또는 저산소증의 영향이 없고 각 클론/저산소증 조합에서 3개의 복제 간에 차이가 없는 경우 예상되는 읽기 수를 포함하는 읽기 열을 사용하여 24개의 더미 행이 생성되었습니다. 실제 24행. :ObsExp 열의 더미 행에는 "Exp"라는 레이블이 지정되었고 원래 실제 관측값에는 "Obs"라는 레이블이 지정되었습니다. 이제 우리는 Obs가 Exp와 다른 독립 변수가 무엇인지, 그리고 그렇다면 어떤 독립 변수로 인해 다른지 알고 싶습니다. 이를 달성하기 위해 나는 실행합니다(지금보다 원시 :reads가 Freq로 사용되는 것이 아니라 RPKM이 아닌 것을 관찰하십시오:
적합모델(
빈도( :읽기),
Y( :ObsExp ),
효과(
:클론,
:급성저산소증,
:급성저산소증 * :클론,
:rep[:Clone, :급성저산소증]
),
성격( 명목형 로지스틱 ),
실행( 우도비 검정( 1 ), Wald 검정( 0 ) ),
SendToReport( Dispatch( {}, "매개변수 추정치", OutlineBox, {Close( 1 )} ) )
)
예상대로 결과는 훨씬 더 강력해졌습니다.
효과 가능성 비율 테스트
소스 Nparm DF LR ChiSquare Prob>ChiSq
클론 3 3 208.563245 <.0001
급성저산소증 1 1 114.216936 <.0001
급성저산소증*클론 3 3 54.2042677 <.0001
대표[복제,급성저산소증] 16 16 92.4764669 <.0001
참고: 다음을 사용하면 정확히 동일한 결과를 얻을 수 있습니다.
성격( 일반화 선형 모형 ),
GLM 분포( 이항 ),
링크함수( Logit )
답: RNAseq 데이터에 대한 일반화 선형 모델 또는 명목 로지스틱답변해주셔서 감사합니다.
분석과 같은 t-테스트를 수행할 수는 없다고 생각합니다. 반복실험은 분석을 수행하기 위한 변동성 추정 및 자유도의 소스이며 중첩될 필요가 없습니다. JMP 용어로 중첩하면 다음과 같습니다.
한 효과(B)의 수준이 다른 효과(A)의 단일 수준 내에서만 발생하는 경우 B는 다음과 같다고 합니다. 중첩된 A(B[A]) 내.
이는 B 수준의 특정 수준이 Env의 특정 수준 내에서만 적용될 수 있도록 요인(B)이 있어야 함을 의미합니다. 그래서. 요인 B의 수준 1과 2는 Env A에서만 발생하고 요인 B의 수준 3과 4는 Env에서만 발생합니다. 비. Env가 모델 효과인 경우 복제는 Env의 연관된 수준 내에 있는 것으로 암시됩니다. 따라서 각 Env 수준에 명시적으로 할당할 필요가 없습니다.
JMP를 사용하면 이 작업을 수행할 수 있지만 통계적으로 타당하거나 의미가 있다고 생각하지 않습니다.
또한 반복실험을 무작위로 수행하는 것도 암시적이므로 필요하지 않습니다(3개의 반복실험은 처음부터 무작위 표본이어야 하며 일반화 선형 모델 또는 일반화 회귀 분석에서는 허용되지 않습니다).
이 경우 읽기는 Y이며 Freq 옵션이 기대한 대로 작동하지 않을 것이라고 생각합니다(일반적으로 해당 옵션을 피하십시오). 포아송은 일반화 선형 모형, 음이항 또는 일반화 회귀 분석을 위한 포아송(JMP Pro)을 사용하는 분포입니다.
1000개의 유전자에 대해 이 작업을 수행해야 한다고 생각합니까?
예시 테이블을 보내주셔서 감사합니다. 이 토론을 진행하기 위해 분석용으로 저장된 스크립트가 포함된 테이블을 만들었습니다. 이 토론에 사용하기 위해 추가 열(Replicate 및 Replicate ID)을 만들었습니다.
답: RNAseq 데이터에 대한 일반화 선형 모델 또는 명목 로지스틱복제물은 다른 개인의 것입니다. 생물학적 복제. 그리고 당신의 말이 절대적으로 옳습니다. 그것들을 하나로 모으는 것은 좋은 생각이 아닙니다. 그러나 복제를 무작위 독립 변수로 내 모델에 포함하고 환경 처리 내에 중첩하여 기본적으로 이 설계를 블록 설계로 처리할 수 있습니다. 동일한 실험이 3번 반복되었습니다.
나는 일반적인 접근 방식에 대해 더 걱정하고 있습니다. 귀무 가설 하에서 예상되는 "개수"(즉, 모든 곳에서 동일한 읽기 수)로 더미 관찰을 생성하고 분할표/명목 물류 모델을 사용하여 실제 수가 다른지 확인하는 것입니다.
다른 사용자가 제안한 대로 실제 데이터가 포함된 예제를 게시하겠습니다.
답: RNAseq 데이터에 대한 일반화 선형 모델 또는 명목 로지스틱안녕 @l_yampolsky ,
명확하게 말하면 각 환경마다 세 개의 샘플(복제본)이 있습니다. 그러나 각 환경에 대한 반복실험을 결합하고 분석과 같은 t-검정을 수행하는 대신, 개수가 해당 샘플의 성적표 모집단에서 해당 특정 성적표(성적표 A)의 관찰 수를 나타내는 것처럼 각 샘플을 처리하려고 합니다. 동일한 환경의 다음 샘플은 동일한 성적표 모집단에서 새로운 관찰 세트를 추출하고 동일한 성적서 A에 몇 개가 있는지 관찰하는 것과 같습니다. 내가 제대로 이해한 걸까?
질문: 각 샘플은 동일한 개인(즉, 해당 개인 내의 세포 집단 샘플, 따라서 기술적 복제)에서 나온 것입니까, 아니면 동일한 환경의 다른 개인(즉, 각 개인의 샘플이므로 다른 모집단 샘플을 나타냄)에서 나온 것입니까? 동일한 환경을 경험한 세포 수)?
샘플이 다른 개인의 것이라면 이것이 유효한 접근 방식이라고 생각하지 않습니다. 개수는 환경의 일부 변화에 대한 반응입니다. 이는 테스트 환경에서 광원으로부터 특정 파장의 광자 수를 세고 이를 동일한 환경에서 유사한 광원을 사용하는 다른 장치의 동일한 파장의 광자 수와 합치는 것과 같습니다. . 이들은 동일한 광원(또는 장치)이 아니라 동일한 광원을 대표하므로 서로 독립적으로 취급되어야 합니다. 이는 장치 간 가변성을 나타내며 각 장치가 다른 장치의 정확한 복사본이 아니기 때문에 별도로 추적해야 합니다. 그렇다면 모든 광자는 단일 소스에서 나오고 각 샘플은 해당 소스의 대표 샘플이 되므로 테스트에 여러 장치가 필요하지 않습니다.
RNAseq은 샘플에서 엔터티 또는 전사물의 풍부함을 정량화하려는 노력이라는 점에서 유사합니다. 다음 표본은 일반적으로 동일한 소스 모집단의 표본이 아닙니다. 이는 일반적으로 다른 개인의 샘플이므로 그런 식으로 처리해야 합니다. 개인 대 개인의 가변성. 동일한 개인의 동일한 조직에서 채취한 샘플이라도 다양성(다양한 분열 상태의 세포, 기능의 계층화 등)이 있으므로 동일한 세포 집단에서 나온 것처럼 통합해서는 안 됩니다.
궁극적으로 이 모든 것은 제기되는 과학적 질문과 해당 질문에 대한 답을 찾는 데 사용된 실험 설계에 따라 달라집니다. 당신은 그것들을 모아서 당신이 원하는 것을 할 수도 있고 그렇지 않을 수도 있습니다. 때에 따라 다르지....
답: RNAseq 데이터에 대한 일반화 선형 모델 또는 명목 로지스틱다양한 분석이 포함된 예제 데이터 표를 첨부하면 도움이 될 수 있습니다. 텍스트 설명에서 데이터 테이블을 상상하는 것보다 이해하기가 훨씬 쉽다는 것을 알았습니다.
