RNAseq データの一般化線形モデルまたは名目ロジスティック同僚、
1 回のシーケンス実験で、2 つの環境でそれぞれ 3 回の複製で測定されたリード数の形式で RNAseq データがあると想像してください。 このような：
環境読み取り
A9
A10
A11
B4
B5
B6
もちろん、各読み取りカウントを独立変数として扱い、テスト時に実行することもでき、検出力は非常に低くなります。 代わりに、各リードを観察として扱い、1 回のシーケンス処理で、環境 B のサンプルでは 15 リードが得られたのに対し、環境 A では 30 リードが得られたことに気づきたいと考えています。 これは偶然に観察される可能性は非常に低く、環境 A と環境 B の間の違いを検出する私の能力ははるかに高く、t 検定の場合とは異なり、配列決定の努力とともに増加します。 (典型的な RAseq 実験では、読み取り数ははるかに多く、一部の遺伝子ではサンプルあたり数百であることがよくあります。2 倍のカウント差は非常に重要です)。
おそらく 3 つの異なる独立変数を使用して、より複雑なモデルでこの偶発性テストを実行できるようにしたいと考えています (そしてブロック効果として複製します)。
簡単な解決策は次のとおりです。追加のカテゴリ変数を作成し、Observed と Expected の値を持つ「Model」と呼びます。「Observed」は上の行に対応し、「Expected」は同じ行数ですが、列は次のようになります。有意な影響がない場合は、期待されるカウントを含む読み取り。つまり、この場合は平均読み取りカウント (各反復での労力が等しいと仮定)。
そして、これを実行します:
モデルの適合( Freq( :reads ), Y( :Model ), Effects( :Env, :rep ), Personality( Nominal Logistic ), Run(尤度比検定( 1 ), Wald検定( 0 ) ) )
...またはこれ (同じ結果が得られます。理由はよくわかりませんが、満足しています):
モデルの適合( Freq( :reads )、Y( :Model )、効果( :Env、:rep )、パーソナリティ( 一般化線形モデル )、GLM分布( 二項 )、リンク関数( ロジット )、過分散テストおよび間隔( 0 ) , Name( "ファースバイアス調整済み推定値" )(0), Run )
私は何かとんでもなく間違ったことをしているのでしょうか、それともこれは有効なテストとして意味があるのでしょうか?
それが理にかなっている場合、予想されるカウントを含む追加の行を作成せずに同じことを達成する方法はおそらくありますか?
前もって感謝します！！
L.ヤンポルスキー
データの探索と視覚化品質およびプロセスエンジニアリングRe: RNAseq データの一般化線形モデルまたは名目ロジスティックありがとう、これはとても役に立ち、もう少し意味が分かりました。私も (他の人たちと同様に) アプローチの健全性チェックを行うつもりです。
Re: RNAseq データの一般化線形モデルまたは名目ロジスティック@l_yampolskyご質問ありがとうございます。これと同じ問題が、応答を二項から二項に変換するときに一般化線形混合モデルでも発生します。このような状況では、元のサンプルがランダム効果であると宣言することが不可欠です。そうしないと、結果は完全に誤解を招くことになります。
残念ながら、これは 2 番目の分析にも当てはまります。実際には元のサンプルごとにクラスター化されているにもかかわらず、すべての観測値が独立していると事実上仮定していることになります。2 番目の分析を修正するには、反復効果をランダムであると宣言し、パーソナリティを標準最小二乗法に変更するか、JMP Pro を使用している場合は混合モデルに変更して、応答を連続的にする必要があります (log2 変換することをお勧めします)。あるいは、Poisson 応答を保持したい場合は、Meichen Dong がコミュニティのここからダウンロードできる GLMM 用のアドインを持っています。彼女のドキュメントには RNASeq の例もあります。一般化線形混合モデル アドイン
結論から言えば、実際にはエラーの自由度は 16 度しかなく、それをごまかすことはできません。
6K トランスクリプトに対する複数のテストを懸念するのは当然です。特定のトランスクリプトが既知で、事前に指定されている場合は、単一のトランスクリプト分析を最初のトランスクリプト分析または変更された 2 番目のトランスクリプト分析として表示できる可能性があります。フルセットについては、火山プロットを作成して何が得られるかを確認してください。もう 1 つのアイデアは、1 つ以上の遺伝子または経路スコア (関連する転写産物の平均) を構築し、それらを分析することです。
Re: RNAseq データの一般化線形モデルまたは名目ロジスティック上のスレッドに例を投稿しました。
貴重なご意見をいただきありがとうございます。
L.ヤンポルスキー
Re: RNAseq データの一般化線形モデルまたは名目ロジスティック以下に例を示します。
公称応答の例を含む一般化線形モデル
データファイル：Example1Fp52.43_cH8.jmp
ヒトミトコンドリアキャリアタンパク質Alarar1の甲殻類ホモログの発現を、4つのクローンで研究しました。ミジンコ急性低酸素状態にさらされました（低酸素状態が 3 回、対照が 3 回反復）。 4 クローン x 2 処理 x 3 反復 = 24 行。
まず、RPKM を応答変数として、低酸素とクローンを因子として使用して、二元配置分散分析を実行しました。
フィットモデル(
Y( :RPKM )、
効果( :Clone, :acuteHypoxia, :Clone * :acuteHypoxia ),
性格(標準最小二乗法)、
強調(最小限のレポート)、
走る（
:RPKM << {適合度の欠如( 0 )、予測による実際のプロット( 0 )、
回帰のプロット( 0 )、予測による残差のプロット( 0 )、
プロット効果レバレッジ( 0 )}
)
）
その結果、次のような結果が得られます。
応答RPKM
効果試験
ソース Nparm DF 二乗和 F 比確率 > F
クローン 3 3 10222.900 3.6649 0.0349
急性低酸素症 1 1 42430.209 45.6339 <.0001
クローン*急性低酸素症 3 3 12083.132 4.3318 0.0205
OK、物事は重要ですが、クローンと相互作用の影響は、いかなる種類の複数のテスト修正にも耐えられません (これは、RNAseq データ内の約 6,000 個の転写産物の一例にすぎません)。
次に、クローンまたは低酸素の影響がなく、クローン/低酸素の各組み合わせにおける 3 つの複製の間で差がない場合に備えて、予想されるリード数を含むリード列を含む 24 のダミー行が作成されました。つまり、実際は 24 行です。 ダミー行には :ObsExp 列の「Exp」というラベルが付けられ、元の実際の観測値には「Obs」というラベルが付けられました。 ここで、Obs が Exp と異なるかどうか、また、そうである場合には、どの独立変数によって Obs が異なるのかを知りたいと考えます。 これを達成するために、私は実行します（RPKMではなく生の:readがFreqとして使用されていることを観察してください：
フィットモデル(
Freq( :reads )、
Y( :ObsExp )、
エフェクト(
：クローン、
:急性低酸素症、
:急性低酸素症 * :クローン、
:rep[:クローン、:急性低酸素症]
）、
人格(名目上のロジスティック)、
Run( 尤度比検定( 1 )、ワルド検定( 0 ) )、
SendToReport( Dispatch( {}, "パラメータ推定", OutlineBox, {Close( 1 )} ) )
）
その結果、予想どおり、はるかに多くのパワーが得られます。
影響尤度比検定
ソース Nparm DF LR カイ二乗確率 Prob>ChiSq
クローン 3 3 208.563245 <.0001
急性低酸素症 1 1 114.216936 <.0001
急性低酸素症*クローン 3 3 54.2042677 <.0001
rep[クローン、急性低酸素症] 16 16 92.4764669 <.0001
注: これを使用してもまったく同じ結果が得られます。
性格(一般化線形モデル)、
GLM 分布(二項分布)、
リンク関数(ロジット)
Re: RNAseq データの一般化線形モデルまたは名目ロジスティックご回答ありがとうございます。
t 検定のような分析を行うことは避けられないと思います。 レプリケートは変動推定のソースであり、分析を実行するための自由度であり、ネストする必要はありません。 JMP 用語でネストすると次のようになります。
ある効果 (B) のレベルが別の効果 (A) の単一レベル内でのみ発生する場合、B は入れ子になったA（B[A]）内。
つまり、B レベルの特定のレベルが環境の特定のレベル内でのみ適用されるような係数 (B) が必要です。 それで。因子 B のレベル 1 とレベル 2 は環境 A でのみ発生し、因子 B のレベル 3 とレベル 4 は環境 A でのみ発生します。 B. Env がモデル効果である場合、複製は Env の関連レベル内にあることが暗示されます。 したがって、それらを各 Env レベルに明示的に割り当てる必要はありません。
JMP ではこれを行うことができますが、統計的に有効または意味があるとは思えません。
また、反復をランダムとして指定することも暗黙的に行われるため、必要ありません (3 つの反復は最初からランダムなサンプルである必要があり、一般化線形モデルまたは一般化回帰では許可されません)。
この場合、Reads は Y であり、Freq オプションが期待どおりの動作をしないとは思えません (通常はこのオプションを避けてください)。 ポアソンは、一般化線形モデルまたは負の二項式、または一般化回帰 (JMP Pro) のポアソンを使用する分布になります。
何千もの遺伝子に対してこれを行う必要があると思いますか？
サンプルテーブルを送っていただきありがとうございます。 この議論を進めるために、分析用に保存されたスクリプトを含む表を作成しました。 この説明で使用するために、追加の列 (レプリケートとレプリケート ID) を作成しました。
Re: RNAseq データの一般化線形モデルまたは名目ロジスティックレプリカは異なる個人からのものです。生物学的複製。 そして、あなたは完全に正しいです、それらをプールすることは良い考えではありません。 ただし、replicate をランダムな独立変数としてモデルに組み込み、環境処理内にネストして、基本的にこの設計をブロック設計として扱うことができます。同じ実験を 3 回繰り返します。
私は一般的なアプローチのほうを心配しています。帰無仮説の下で予想される「カウント」（つまり、どこでも等しいリードカウント）でダミーの観測値を作成し、分割表/名目ロジスティクスモデルを使用して実際のカウントが異なるかどうかを確認します。
別のユーザーが提案したように、実際のデータを使用した例を投稿します。
Re: RNAseq データの一般化線形モデルまたは名目ロジスティックこんにちは@l_yampolsky 、
明確にするために、各環境には 3 つのサンプル (複製) があります。 ただし、各環境の複製を結合して t 検定のような分析を行うのではなく、カウントがそのサンプルからの転写産物の母集団における特定の転写産物 (転写物 A) の観察数を表すかのように各サンプルを扱う必要があります。 同じ環境からの次のサンプルは、同じトランスクリプトの母集団から新しい一連の観察を抽出し、同じトランスクリプト A がいくつあるかを観察するようなものです。 私はそれを正しく理解しましたか？
質問: 各サンプルは同じ個体からのものですか (つまり、その個体内の細胞集団のサンプル、したがって技術的に複製されたものです)、それとも同じ環境内の異なる個体からのものですか (つまり、各個体のサンプルであり、したがって異なる集団を表すサンプルです)同じ環境を経験した細胞の数）？
サンプルが異なる個人からのものである場合、これは有効なアプローチではないと思います。 カウントは環境の何らかの変化に対する反応です。 これは、テスト環境内の光源からの特定の波長の光子の数を数え、それを同じ環境にある同様の光源の別の、しかし異なるデバイスからの同じ波長の光子の数とプールするようなものです。 。 これらは同じ光源 (またはデバイス) ではなく、同じ光源を表すものであり、互いに独立して扱う必要があります。 これはデバイス間の変動を表しており、各デバイスは他のデバイスの正確なコピーではないため、個別に追跡する必要があります。 そうであれば、すべての光子は単一のソースから来ており、各サンプルはそのソースの代表的なサンプルとなるため、テストに複数のデバイスは必要ありません。
RNAseq は、サンプル内のエンティティまたは転写物の存在量を定量化する取り組みであるという点で似ています。 次のサンプルは通常、同じソース集団からのサンプルではありません。 通常、これは別の個人からのサンプルであるため、そのように扱う必要があります。 個人差があります。 同じ個体の同じ組織からのサンプルであっても、ばらつき（細胞の分裂状態や機能の層別など）が異なるため、同じ細胞集団からのものであるかのようにプールすべきではありません。
結局のところ、これはすべて、問われている科学的な疑問と、その疑問に対する答えを見つけるために使用された実験計画に大きく依存します。 それらをプールして、やりたいことを実行できる場合もあれば、実行できない場合もあります。 場合によります....
Re: RNAseq データの一般化線形モデルまたは名目ロジスティックさまざまな分析にサンプル データ テーブルを添付すると役立つ場合があります。 テキストの説明からデータテーブルを想像するよりも、はるかに理解しやすいと思います。
