Colleghi,
Immagina di avere i dati RNAseq sotto forma di conteggio delle letture misurati in 2 ambienti, con 3 replicati ciascuno, in un singolo esperimento di sequenziamento. Come questo:
Env legge
A 9
A 10
A 11
B 4
B 5
B 6
Ovviamente posso considerare ogni lettura come una variabile indipendente e fare un test e avrò una potenza molto bassa. Invece, voglio essere in grado di trattare ogni lettura come un'osservazione e poi notare che in un singolo sforzo di sequenziamento dato ho ottenuto 15 letture in campioni dall'ambiente B, ma 30 letture in campioni dall'ambiente A. È altamente improbabile che venga osservato per caso e il mio potere di rilevare le differenze tra gli ambienti A e B è molto, molto più alto e aumenterà con lo sforzo di sequenziamento, a differenza di quello di un test t. (In un tipico esperimento RAseq il numero di letture è molto più alto, per alcuni geni spesso in centinaia per campione; la differenza di conteggio 2 volte sarà molto significativa).
Voglio essere in grado di fare questo test di contingenza con un modello più complesso, magari con 3 diverse variabili indipendenti (e replicarlo come effetto blocco).
La soluzione facile è quindi questa: creo una variabile categorica aggiuntiva, chiamiamola "Modello" con i valori Observed e Expected, con "Observed" corrispondente alle righe sopra e "Expected" in egual numero di righe, ma con la colonna: letture contenenti il conteggio atteso se nessun effetto è significativo, ovvero, in questo caso, conteggio medio delle letture (assumendo lo stesso sforzo in ogni replica).
E poi esegui questo:
Fit Model (Freq (: reads), Y (: Model), Effects (: Env,: rep), Personality (Nominal Logistic), Run (Likelihood Ratio Tests (1), Wald Tests (0)))
... o questo (che mi dà risultati identici, non capisco bene perché, ma ne sono contento):
Fit Model (Freq (: reads), Y (: Model), Effects (: Env,: rep), Personality (Generalized Linear Model), GLM Distribution (Binomial), Link Function (Logit), Overdispersion Tests and Intervals (0) , Nome ("Stime aggiustate per distorsione Firth") (0), Esegui)
Sto facendo qualcosa di ridicolmente sbagliato o ha senso come un test valido?
Se ha senso, c'è forse un modo per ottenere lo stesso risultato senza la necessità di creare linee aggiuntive con i conteggi previsti?
Grazie in anticipo!!
L. Yampolsky
Ciao @l_yampolsky ,
Per essere chiari, per ogni ambiente hai tre campioni (repliche). Ma invece di combinare le repliche per ciascun ambiente ed eseguire un'analisi simile al t-test, si desidera trattare ogni campione come se il conteggio rappresentasse il numero di osservazioni di quella particolare trascrizione (trascrizione A) nella popolazione di trascrizioni di quel campione. Il prossimo campione da quello stesso ambiente è come disegnare una nuova serie di osservazioni dalla stessa popolazione di trascrizioni e osservare quante sono della stessa trascrizione A. Ho capito bene?
Domanda: ogni campione proviene dallo stesso individuo (cioè un campione della popolazione di cellule all'interno di quell'individuo, quindi repliche tecniche) o provengono da individui diversi nello stesso ambiente (cioè un campione di ciascun individuo e quindi rappresenta un campione di popolazioni diverse di cellule che hanno vissuto lo stesso ambiente)?
Se i campioni provengono da individui diversi, non credo che questo sia un approccio valido. I conteggi sono la risposta a qualche cambiamento di ambiente. È come contare il numero di fotoni di una particolare lunghezza d'onda da una sorgente di luce in un ambiente di prova e poi metterlo in comune con il conteggio di fotoni della stessa lunghezza d'onda da un altro, ma diverso, dispositivo di sorgente di luce simile e anche nello stesso ambiente . Non sono la stessa sorgente luminosa (o dispositivo), ma rappresentanti della stessa sorgente luminosa e devono essere trattati indipendentemente l'uno dall'altro. Ciò rappresenterebbe la variabilità da dispositivo a dispositivo e deve essere monitorato separatamente poiché ogni dispositivo non è una copia esatta dell'altro. Se lo fossero, non sarebbero necessari più dispositivi per il test poiché tutti i fotoni proverrebbero da un'unica sorgente e ogni campione sarebbe un campione rappresentativo di tale sorgente.
RNAseq è simile in quanto è uno sforzo di quantificazione dell'entità, o l'abbondanza di una trascrizione, in un campione. Il campione successivo non è in genere un campione della stessa popolazione di origine. Di solito è un campione di un individuo diverso e quindi deve essere trattato in questo modo. Variabilità da individuo a individuo. Anche i campioni dello stesso tessuto dello stesso individuo presentano variabilità (cellule in diversi stati di divisione, stratificazione della funzionalità, ecc.) e non devono essere raggruppati come se provenissero dalla stessa popolazione di cellule.
In definitiva, tutto questo dipende davvero dalla domanda scientifica che viene posta e dal disegno sperimentale utilizzato per scoprire la risposta a quella domanda. Potresti essere in grado di metterli in comune e fare quello che vuoi o forse no. Dipende....
Le repliche provengono da individui diversi; repliche biologiche. E hai assolutamente ragione, metterli in comune non sarebbe una buona idea. Tuttavia, posso includere replica come variabile indipendente casuale nel mio modello, annidato all'interno di trattamenti ambientali, trattando essenzialmente questo design come un design a blocchi: lo stesso esperimento ripetuto 3 volte.
Sono più preoccupato per l'approccio generale: creare osservazioni fittizie con "conteggi" previsti in ipotesi nulla (cioè, conteggi uguali di letture ovunque) e utilizzare una tabella di contingenza / modello logistico nominale per vedere se i conteggi effettivi differiscono.
Come suggerito da un altro utente, pubblicherò un esempio con i dati effettivi.
