Kollegen,
Stellen Sie sich vor, ich habe RNAseq-Daten in Form von Lesezahlen, die in 2 Umgebungen mit jeweils 3 Wiederholungen in einem einzigen Sequenzierungsexperiment gemessen wurden. So was:
Env liest
A 9
A 10
A 11
B 4
B 5
B 6
Natürlich kann ich jede Anzahl von Lesevorgängen als unabhängige Variable behandeln und beim Test ausführen, und ich werde eine sehr geringe Leistung haben. Stattdessen möchte ich in der Lage sein, jeden Lesevorgang als Beobachtung zu behandeln und dann zu bemerken, dass ich bei einem bestimmten Sequenzierungsaufwand 15 Lesevorgänge in Proben aus Umgebung B, aber 30 Lesevorgänge in Proben aus Umgebung A erhalten habe. Es ist sehr unwahrscheinlich, dass dies zufällig beobachtet wird, und meine Fähigkeit, Unterschiede zwischen den Umgebungen A und B zu erkennen, ist viel, viel höher und wird im Gegensatz zu einem T-Test mit dem Sequenzierungsaufwand zunehmen. (In einem typischen RAseq-Experiment ist die Anzahl der Lesevorgänge für einige Gene häufig höher, häufig in Hunderten pro Probe; der zweifache Zählungsunterschied ist sehr signifikant).
Ich möchte diesen Kontingenztest mit einem komplexeren Modell durchführen können, möglicherweise mit 3 verschiedenen unabhängigen Variablen (und als Blockeffekt replizieren).
Die einfache Lösung lautet dann: Ich erstelle eine zusätzliche kategoriale Variable, nenne sie "Modell" mit beobachteten und erwarteten Werten, wobei "beobachtet" den obigen Zeilen entspricht und "erwartet" in der gleichen Anzahl von Zeilen, aber mit der Spalte: Lesevorgänge, die die erwartete Anzahl enthalten, wenn kein Effekt signifikant ist, dh in diesem Fall die durchschnittliche Lesezahl (unter der Annahme des gleichen Aufwands bei jedem Replikat).
Und dann führen Sie dies aus:
Modell anpassen (Frequenz (: liest), Y (: Modell), Effekte (: Env ,: rep), Persönlichkeit (nominelle Logistik), Lauf (Likelihood Ratio Tests (1), Wald Tests (0)))
... oder dies (was mir identische Ergebnisse liefert, ich verstehe nicht ganz warum, aber ich bin damit zufrieden):
Anpassungsmodell (Frequenz (: liest), Y (: Modell), Effekte (: Env ,: rep), Persönlichkeit (verallgemeinertes lineares Modell), GLM-Verteilung (Binomial), Verknüpfungsfunktion (Logit), Überdispersionstests und Intervalle (0) , Name ("Firth Bias-Adjusted Estimates") (0), Run)
Mache ich etwas lächerlich Falsches oder macht dies als gültiger Test Sinn?
Wenn es sinnvoll ist, gibt es vielleicht eine Möglichkeit, dasselbe zu erreichen, ohne zusätzliche Zeilen mit erwarteten Zählwerten erstellen zu müssen?
Danke im Voraus!!
L. Yampolsky
Hallo @l_yampolsky ,
Zur Verdeutlichung haben Sie für jede Umgebung drei Beispiele (Replikate). Aber anstatt die Replikate für jede Umgebung zu kombinieren und eine t-Test-ähnliche Analyse durchzuführen, möchten Sie jede Probe so behandeln, als ob die Anzahl die Anzahl der Beobachtungen dieses bestimmten Transkripts (Transkript A) in der Population der Transkripte aus dieser Probe darstellt. Die nächste Stichprobe aus derselben Umgebung ist so, als würde man einen neuen Satz von Beobachtungen aus derselben Population von Transkripten ziehen und beobachten, wie viele von demselben Transkript A stammen. Hab ich das richtig verstanden?
Frage: Ist jede Probe von demselben Individuum (dh eine Probe der Zellpopulation innerhalb dieses Individuums, also technische Replikate) oder sind sie von verschiedenen Individuen in derselben Umgebung (dh eine Probe jedes Individuums und repräsentieren somit eine Stichprobe verschiedener Populationen von Zellen, die die gleiche Umgebung erfahren haben)?
Wenn die Proben von verschiedenen Personen stammen, halte ich dies für keinen gültigen Ansatz. Die Zählungen sind die Reaktion auf eine Änderung in der Umgebung. Es ist, als würde man die Anzahl der Photonen einer bestimmten Wellenlänge von einer Lichtquelle in einer Testumgebung zählen und sie dann mit der Anzahl der Photonen derselben Wellenlänge von einem anderen, aber unterschiedlichen Gerät einer ähnlichen Lichtquelle und auch in derselben Umgebung zusammenfassen . Sie sind nicht dieselbe Lichtquelle (oder Gerät), sondern Vertreter derselben Lichtquelle und müssen unabhängig voneinander behandelt werden. Dies würde eine Variabilität von Gerät zu Gerät darstellen und muss separat verfolgt werden, da jedes Gerät keine exakte Kopie des anderen ist. Wenn dies der Fall wäre, wären für den Test nicht mehrere Geräte erforderlich, da alle Photonen aus einer einzigen Quelle stammen würden und jede Probe eine repräsentative Probe dieser Quelle wäre.
RNAseq ist insofern ähnlich, als es darum geht, die Entität oder die Häufigkeit eines Transkripts in einer Probe zu quantifizieren. Die nächste Stichprobe ist normalerweise keine Stichprobe aus derselben Quellpopulation. Es handelt sich in der Regel um eine Probe von einer anderen Person und muss daher auch so behandelt werden. Individuell zu individueller Variabilität. Sogar Proben aus demselben Gewebe von demselben Individuum weisen Variabilität auf (Zellen in verschiedenen Teilungsstadien, Schichtung der Funktionalität usw.) und sollten nicht so zusammengefasst werden, als kämen sie aus derselben Zellpopulation.
Letztendlich hängt dies alles wirklich davon ab, welche wissenschaftliche Frage gestellt wird und welches experimentelle Design verwendet wurde, um die Antwort auf diese Frage zu finden. Sie können sie möglicherweise zusammenlegen und tun, was Sie wollen oder auch nicht. Es hängt davon ab, ob....
Replikate stammen von verschiedenen Personen; biologische Repliken. Und Sie haben vollkommen recht, sie zu bündeln wäre keine gute Idee. Ich kann jedoch replizieren als zufällige unabhängige Variable in mein Modell aufnehmen, die in Umgebungsbehandlungen verschachtelt ist, und dieses Design im Wesentlichen als Blockdesign behandeln - dasselbe Experiment wird dreimal wiederholt.
Ich mache mir mehr Sorgen über den allgemeinen Ansatz - das Erstellen von Dummy-Beobachtungen mit erwarteten "Zählungen" unter Nullhypothese (dh gleiche Anzahl von Lesevorgängen überall) und die Verwendung eines Kontingenztabellen- / Nominallogistikmodells, um zu sehen, ob sich die tatsächlichen Zählungen unterscheiden.
Ich werde, wie ein anderer Benutzer vorgeschlagen hat, ein Beispiel mit den tatsächlichen Daten posten.
