QbD 专栏：响应面方法和顺序探索编者注：这篇文章是由@龙克内特, @大卫_s和本尼·约斯科维奇的凯帕集团。 它是一系列博客文章的一部分，称为QbD 专栏。 有关作者的更多信息，请单击上面作者的社区名称。
Ron KenettRon KenettRon KenettRon Kenett罗恩·肯尼特
David SteinbergDavid SteinbergDavid SteinbergDavid Steinberg大卫·斯坦伯格
Benny YoskovichBenny YoskovichBenny YoskovichBenny Yoskovich本尼·约斯科维奇
乔治·博克斯和 KB 威尔逊在一篇著名文章中介绍了响应面法的思想[1] 1951年。 文章中有几个新颖且非常有用的想法：
- 设计的实验可以成为实验优化条件的一个很好的工具。
- 当反馈很快时，将实验工作分解为一系列实验比试图“立即学习所有内容”有很大的好处。
- 一项实验的结果通常会刺激策略的变化：可能会添加新的因素，可能会删除旧的因素，可能会移动因素范围。
- 结果可能表明需要更复杂的回归模型来充分反映因素与结果之间的关系。
典型的响应面研究从筛选实验开始，以确定最重要的因素。 小型正交实验计划和简单回归模型通常用于筛选（请参阅我们的第二和第三本系列博客文章）。 后续实验将取决于筛选实验的结果。 例如，影响较小的因素可能会被排除在进一步考虑之外。 可能会添加其他因素。 团队可能决定改变某些因素的水平，以获得关键质量属性 (CQA) 的更好结果。 如果结果表明一阶模型不再适合数据，团队就会扩展设计以允许拟合二阶回归模型。 为此目的，博克斯和威尔逊提出了中央复合设计，直到今天，它仍然是一个流行的选择。
QbD 中如何使用响应面方法？
许多 QbD 研究旨在确定改进的生产条件，并能够利用顺序实验的优势。 这些研究可以受益于响应面方法。
我们通过 Xu、Khan 和 Burgess 报告的一项研究来说明该方法和一些方法[2] 。 他们的目标是利用设计好的实验，通过脂质体配方来改进一类分子的药物输送系统。 预计此类制剂将通过提高体内分子活性的靶向能力来带来益处。 然而，之前的努力所产生的方法在商业上不可行，主要是因为一个重要的关键质量属性（CQA），即封装效率太低。
实验团队在这一系列实验中重点关注了三个 CQA：封装效率（目标至少为 20%）；粒径（目标范围为100-200 nm）；和 4⁰ C 下的储存稳定性。 他们还进行了风险分析，以确定要研究哪些过程因素，最终总结出八个因素：脂质浓度；药物浓度；挤压压力；胆固醇浓度；缓冲液浓度；水合时间；超声处理时间；和冻融循环次数。
使用什么设计进行因子筛选？
第一个实验的目的是从八个因素中找出最重要的因素。 该团队想要进行小型、经济的实验，因此选择使用 12 次运行的 Plackett 和 Burman (PB) 实验。 这是一个正交实验，最多可以筛选 11 个因素，每个因素有两个水平。 与大多数 PB 设计一样，12 次试验的设计并未完全将两因素交互作用与主效应混叠。 有时，这对筛选有有益的影响，当只有两个或三个活性因子时，能够检测到特别大的相互作用。 该团队还添加了三个中心点，从而可以对变异性进行纯误差估计，并检查是否需要纯二次项。
很容易生成 PB 设计联合管理计划使用筛选设计平台美国能源部。 输入因子后，选中用于从正交设计列表中进行选择的框，12 次试验的 PB 设计由于其经济的试验规模而位于列表顶部。选择此设计后，可以选择添加中心点。
该团队研究了实验的三个直接结果：封装效率（EE）；粒径；和 zeta 电位。 此外，每种配方均经过稀释并分成样品进行储存，一半在 4⁰ C 下，一半在 37⁰ C 下储存。 在预定时间（最多 24 个月）测试这些样品在储存期间活性药物的损失。
数据分析的结果是什么？
15 次实验的 EE 范围为 8.2% 至 36.5%。 图 1 显示了 EE 数据分析的摘要。 脂质浓度显然是最重要的因素——增加脂质浓度会导致更高的 EE。 药物浓度也非常显着，对 EE 有负面影响。 其他因素均未达到统计显着性，并且与两个强因素相比，所有因素的影响都非常小。 数据的拟合度非常好。 残余标准差为0.87%（与EE结果的范围相比相当小），并且没有证据表明不适合。
图 1：初始 PB 实验中因素对 EE 的影响
粒度分析集中于每次实验的平均粒度。 这些平均值均在 160 至 176 nm 之间，完全在可接受的范围内。 这些因素都没有对平均粒径产生强烈影响，这表明该结果对于实验中因素的设置具有高度稳健性。 实验过程中颗粒大小也有所不同，研究小组测量了标准偏差。 SD 均为 3.1 nm 或更小，因此运行中的粒径实际上相当均匀。
Zeta 电位是颗粒之间静电或电荷排斥/吸引力大小的量度，已知会影响稳定性。 PB 设计中运行的所有流程的 zeta 电位都在 61 到 76 之间。 这些因素均对结果没有统计学上的显着影响。
图 2 显示了三个即时响应的 JMP Profiler。 脂质浓度和药物浓度对 EE 的强烈影响如图 2 所示，所有因素对平均粒径和 zeta 电位的影响都很弱。
研究小组还担心储存稳定性。 他们通过测量两年储存期内的药物泄漏来评估稳定性。 对于4°C保存的样品，几乎没有泄漏。 因此，无论工艺因素设置如何，冷藏都能带来出色的稳定性。 37°C保存的样品确实出现了药物泄漏，仅保存两周后平均损失了6.6%。 徐等人。没有提供有关泄漏的数据。 他们文章中的总结分析表明，对渗漏影响最强的因素是脂质浓度；该因子的高设置为 120 导致从 6.6% 下降到 3.4%。 因此，使用较高的脂质浓度有助于增加 EE 和改善储存稳定性。 储存分析的主要结论是，在低温下储存很重要，完成后，无论因素设置如何，药物在长达两年的时间内都可以保持稳定。
图 2：Profiler 显示主效应模型对 EE、粒径和 zeta 电位的影响因素
我们能识别出任何相互作用吗？
我们之前指出，PB 设计的优点之一是，当活跃因素很少时，有可能识别出重要的二因素交互作用。 一种有用的策略是查看具有主动主效应的两个因素之间的所有相互作用，使用逐步回归来确定哪些相互作用最具预测能力。 药物输送实验只发现了两个活性因子，因此它们之间的相互作用是唯一的候选者。 图 3 显示了相应模型的拟合结果。 这种相互作用非常显着，比其他六种主要效应中的任何一种都显着得多。 这有力地表明存在与两个主导因素相关的二阶效应。
请注意，主效应估计值与图 1 中的值相比没有变化 - 这是因为 Plackett-Burman 设计的正交性。 当设计投影到两个因素时，如本分析所示，它对这些因素的四种组合中的每一种都有三个重复，因此添加它们的相互作用不会影响正交性。 然而，当包含更多因素和/或相互作用时，模型不再是正交的，并且效果估计将会改变。
图 3：主要影响脂质浓度、药物浓度及其相互作用的 EE 模型
研究进展如何？
最初的实验明确指出脂质浓度和药物浓度是影响 EE 的两个过程因素。 该团队决定在研究的第二阶段重点关注这两个参数，将所有其他因素保持在默认水平。 他们想要探索这种关系中曲率的可能性，因此选择使用中心复合设计（CCD），它可以拟合完整的二阶模型。 CCD 具有三种类型的实验运行。 一组是两级阶乘。 另一组由中心点组成。 第三组有“轴点”，其中一个因素设置在两个极端水平，所有其他因素都设置在其中心设置。 极端水平可以与用于阶乘点的水平相同（在这种情况下，CCD 具有三个水平的因子），也可以不同（在这种情况下，因子具有五个水平）。
在药物输送研究中，研究小组对每个因素使用了五个水平。 当使用五个水平时，轴点通常设置为阶乘点之外的水平。 因此扩大因子的范围也很常见。 脂质浓度的实验范围从PB实验中使用的范围向上延伸（30-160而不是30-120），并且药物浓度的范围在两个方向上延伸（0.5-8而不是1-5）。 该实验包括 12 次运行：四个因子点、四个轴点（每个因子两个）和四个中心点。
其他策略也可用于增强筛选设计并拟合高阶模型。 当有两个或三个以上的活性因子时，通常可以找到比 CCD 更小的扩展设计，因此更经济。 一种有用的选择是应用 JMP 中的自定义设计平台来构建完整的二次模型。 I 最优设计在这里是一个不错的选择，它具有较小的运行规模和良好的能力来估计整个因子空间的响应函数。
CCD的结果是什么？
研究第二阶段的 EE 结果为 9% 至 41%。 当脂质浓度低至 30 时，EE 值较低，这与初始实验的结果相符。 CCD 专门设计用于让我们使用相对少量的实验运行来拟合完整的二阶模型。 该模型包括每个因素和所有双因素相互作用的线性和二次主效应。 我们使用 JMP 通过“拟合模型”菜单将二阶模型与药物输送系统实验的数据进行拟合。 要构建模型效果，请选择两个实验因素，然后单击宏选项并选择响应面。 图 4 显示了结果。
图 4：二阶模型拟合 CCD 数据
这两个因素具有很强的线性效应，就像最初的筛选实验一样。 这些数字显示了按比例估计的值，并且由于 CCD 中的因子范围更宽，因此系数与更宽的比例相关。 范围的变化导致 CCD 中的系数更大。 这两个因素也具有显着的纯二次效应。 交互作用的大小与原始实验相似，但符号相反。 同样，这很可能与模型被拟合到因子空间中更广泛的范围这一事实有关。 此处交互效应没有达到统计显着性，这可能是由于 CCD 阶乘部分尺寸较小。 在这个实验中，只有四个观察值有助于估计相互作用；在最初的 PB 实验中，所有 12 个观察结果都是相关的。
Profiler（图 5）对于“组合”两个因素的线性和二次效应非常有帮助。 我们可以看到，对于这两个因素，主导效应是线性效应。 整个实验区域的估计效果是单调的。 Profiler 将这两个因素设置为最佳设置，在实验范围内，EE 的估计水平等于 46.9。 二次效应表明，每个因素在低水平时的影响比高水平时的影响更强。 因此，较高水平的脂质浓度可能会产生更高的 EE，但边际效益正在下降。 较低的药物浓度也会产生较高的 EE，并且进一步降低的收益可能是巨大的。 当然，我们总是需要小心在实验范围之外进行推断，任何使用更极端设置的建议都应该在进一步的实验中进行测试。
图 6 显示了基于 CCD 的预测 EE 水平的等值线图。 在高脂质浓度和低药物浓度下获得最高预测值。 使用高脂质浓度可以为实验中包含的整个药物浓度范围提供良好的预测值。
图 5：CCD 的轮廓图
图 6：使用 CCD 模型预测 EE 的等值线图
团队如何验证模型？
为了进一步测试预测 EE 模型的有效性，研究小组进行了许多额外的实验，改变脂质浓度和药物浓度的设置。 例如，1% 和 5% 的药物浓度与 30% 至 150% 范围内的几种脂质浓度相匹配。 其中一些组合位于 CCD 测试区域的边界。 还测试了 CCD 领域内的许多其他组合。 结果显示新数据与基于 CCD 的预测非常吻合。
团队得出了什么结论？
研究团队利用实验得出了该项目中使用的特定活性成分的设计空间。 他们确信这些结论是相当普遍的，并且将证明与许多其他亲水剂相关。 因此，他们将这些实验视为为许多其他设置开发有效程序的跳板。 低温储存的良好结果也非常令人鼓舞。 他们表明，该产品可以在低温下保持稳定长达两年，而无需进行会使生产过程复杂化并增加费用的调整。
本系列的下一篇
本系列的下一篇博客文章将涵盖 QbD 背景下的非线性设计、裂区设计和稳健设计。
参考
[1] Box, G. 和 Wilson, K. (1951)，关于最佳条件的实验实现，英国皇家统计学会杂志。 B 系列（方法论），卷。 13，第 1 期，第 1-45 页。
[2]徐X., Khan, M. 和 Burgess, D. (2012)，关于含有亲水 API 的脂质体的质量设计 (QbD) 案例研究：II。 筛选关键变量并建立实验室规模的设计空间，国际药剂学杂志，423，第 543–553 页。
典型的响应面研究从筛选实验开始，以确定最重要的因素。
