编者注：这个帖子是由@ronkenett ， @david_s和本尼·约斯科维奇的KPA集团。它是一系列博客文章（称为“ QbD栏。有关作者的更多信息，请单击上方的作者社区名称。
罗恩·肯尼特
戴维·斯坦伯格
本尼·约斯科维奇（Benny Yoskovich）
George Box和KB Wilson在一篇著名的文章中介绍了响应面方法的思想[1]在1951年。本文中有几种新颖且极为有用的想法：
- 设计的实验可能是通过实验优化条件的绝佳工具。
- 当反馈很快时，将实验工作分解为一系列实验将有很大的好处，而不是尝试“一次学习所有知识”。
- 一个实验的结果通常会刺激策略的变化：可能会添加新因素，可能会删除旧因素，因素范围可能会改变。
- 结果可能表明需要更复杂的回归模型来充分反映因素与结果之间的关系。
典型的响应面研究从筛选实验开始，以识别最重要的因素。通常使用较小的正交实验计划和简单的回归模型进行筛选（请参见第二和第三本系列的博客文章）。随后的实验将取决于筛选实验的结果。例如，影响较小的因素可能不再考虑。可能会添加其他因素。团队可能决定改变某些因素的水平，以获得关键质量属性（CQA）的更好结果。如果结果表明一阶模型不再适合数据，则团队将扩展设计以允许拟合二阶回归模型。Box and Wilson为此目的提出了中央复合设计，直到今天，它仍然是一个受欢迎的选择。
QbD中如何使用响应面方法？
许多QbD研究旨在确定改进的生产条件，并能够利用顺序实验的优势。这些研究可以受益于响应面方法。
我们通过Xu，Khan和Burgess报告的一项研究来说明这种方法和某些方法[2] 。他们的目标是通过使用脂质体制剂，使用设计好的实验来改善针对一类分子的药物递送系统。期望此类制剂通过改善靶向分子在体内的活性的能力而带来益处。然而，先前的努力产生了在商业上不可行的方法，这主要是因为重要的关键质量属性（CQA），封装效率太低。
实验团队在此实验序列中专注于三个CQA：封装效率（目标至少为20％）；粒径（目标范围为100-200 nm）；他们还进行了风险分析，以确定要研究的工艺因素，并集中在以下八个方面：药物浓度挤出压力胆固醇浓度缓冲液浓度；补水时间超声处理时间；和冻融循环次数。
什么设计用于因素筛选？
第一个实验旨在从八个列表中找到最重要的因素。该小组希望进行一个小型，经济的实验，因此选择使用12次运行的Plackett and Burman（PB）实验。这是一个正交实验，最多可以筛选11个因子，每个因子分为两个级别。像大多数PB设计一样，十二次运行设计不会完全将两因素交互作用与主要效果混为一谈。有时这对筛选具有有益的作用，当只有两个或三个活性因子时，可以检测到特别大的相互作用。该团队还添加了三个中心点，从而可以对可变性进行纯误差估计，并可以检查对纯二次项的需求。
很容易生成PB设计JMP使用内部的筛选设计平台美国能源部。输入因子后，选中从正交设计列表中选择的框，由于其经济的运行尺寸，12线PB设计位于列表的顶部。 选择此设计后，可以选择添加中心点。
该团队研究了该实验的三个直接结果：封装效率（EE）；粒度和ζ电位。另外，将每种制剂稀释并分成样品进行储存，一半在4℃下保存，一半在37℃下保存。在预定的时间（最多24个月）测试这些样品的活性药物在储存期间的损失。
数据分析的结果是什么？
15个实验运行的EE范围为8.2％至36.5％。图1显示了EE数据分析的摘要。血脂浓度显然是最重要的因素-增加血脂浓度可导致更高的EE。药物浓度也非常显着，对EE有负面影响。其他因素均未达到统计学显着性，与两个强因素相比，所有因素的影响都很小。数据拟合度非常好。残留标准偏差为0.87％（与EE结果范围相比很小），没有证据表明缺乏拟合。
图1：初始PB实验中对EE的因子影响
粒度分析着重于每个实验运行的平均粒度。这些平均值均在160至176nm之间，很好地在可接受范围内。这些因素均未对平均粒径产生强烈影响，这表明该结果对实验中这些因素的设置非常有力。粒径也随实验运行而变化，该团队测量了标准偏差。SD均为3.1 nm或更小，因此在运行中粒径实际上非常均匀。
ζ电势是颗粒之间静电或电荷排斥/吸引的大小的量度，并且已知会影响稳定性。PB设计中运行的所有过程的Zeta电位在61至76之间。这些因素均未对结果产生统计学上的显着影响。
图2显示了三个即时响应的JMP Profiler。脂质浓度和药物浓度对EE的强烈影响在图2中显而易见，所有因素对平均粒径和Zeta电位的影响均很弱。
研究团队还担心存储稳定性。他们通过测量两年存储期间的药物泄漏来评估稳定性。对于储存在4℃的样品，几乎没有泄漏。因此，无论工艺因素设置如何，冷藏都具有出色的稳定性。在37°C下储存的样品确实发生了药物泄漏，仅储存了两周后平均损失了6.6％。徐等。没有提供有关泄漏的数据。他们的文章中的总结分析表明，对泄漏影响最大的因素是脂质浓度。此因素的最高设置120导致其从6.6％下降到3.4％。因此，使用较高的脂质浓度有助于增加EE和改善储存稳定性。储存分析的主要结论是，重要的是要在低温下储存，这样做的话，无论因素设置如何，药物最多可以保持两年的稳定期。
图2：探查器显示了主要效应模型中对EE，颗粒大小和zeta电位的因子影响
我们可以识别任何互动吗？
前面我们指出，PB设计的优点之一是，当活动因子很少时，可能有可能确定重要的两因子相互作用。一种有用的策略是查看具有活跃主效应的两个因素之间的所有交互作用，使用逐步回归来确定哪些交互作用最具预测力。药物递送实验仅发现了两个活性因子，因此它们之间的相互作用是唯一的候选对象。图3显示了拟合相应模型的结果。交互作用非常重要，远比其他六个主要效果中的任何一个都重要。这有力地表明存在与两个主导因素相关的二阶效应。
请注意，主要效果估算值与图1中的值没有变化–这是由于Plackett-Burman设计的正交性。如本分析所述，将设计投影到两个因素时，这些因素的四个组合中的每个都有三个重复项，因此添加它们的相互作用不会影响正交性。但是，当包括更多因素和/或相互作用时，模型不再正交，效果估计将发生变化。
图3：具有脂质浓度，药物浓度及其相互作用的主要影响的EE模型
研究如何进行？
最初的实验明确指出脂质浓度和药物浓度是影响EE的两个过程因素。研究小组决定在研究的第二阶段集中于这两个参数，将所有其他因素保持在默认水平。他们想探索这种关系中曲率的可能性，因此选择使用中央复合设计（CCD），该设计可以拟合完整的二阶模型。CCD具有三种类型的实验运行。一组是两级阶乘。另一组包括中心点。第三组具有“轴心点”，其中一个因子设置为两个极端级别，所有其他因子都位于其中心设置。极限水平可以是用于阶乘点的极限水平（在这种情况下，CCD具有三个水平的因子），也可以是不同的（在这种情况下，因素具有五个水平）。
在药物输送研究中，研究小组对每个因素使用了五个水平。当使用五个级别时，通常将轴点设置为阶乘点之外的级别。因此，扩展因素范围也是很常见的。脂质浓度的实验范围从PB实验中使用的范围向上延伸（从30-160而不是30-120），并且药物浓度的范围在两个方向上都得到了扩展（0.5-8而不是1-5）。实验包括12个运行：四个阶乘点，四个轴向点（每个因子两个）和四个中心点。
其他策略也可以用于增强筛选设计并拟合高阶模型。当有两个或三个以上的活动因素时，通常可能会找到比CCD更小，因此更经济的扩展设计。一个有用的选择是在JMP中应用定制设计平台以实现完整的二次模型。在这里，I最优设计是一个不错的选择，它具有较小的运行尺寸，并且具有在整个因子空间中估算响应函数的良好能力。
CCD的结果是什么？
研究第二阶段的EE结果为9％至41％。当脂质浓度低至30时发生低EE，与最初实验的结果相符。CCD经过专门设计，可让我们使用相对较少的实验运行来拟合完整的二阶模型。该模型包括每个因子以及所有两个因子相互作用的线性和二次主效应。我们使用JMP通过Fit Model菜单将二阶模型拟合到来自药物输送系统实验的数据。要构建模型效果，请选择两个实验因素，然后单击巨集选择并选择响应面。图4显示了结果。
图4：适合CCD数据的二阶模型
与原始筛选实验一样，这两个因素具有很强的线性效应。这些图显示了按比例绘制的估计值，并且由于CCD中的因子范围更宽，因此系数与更宽的比例有关。范围的变化会导致CCD中的系数变大。这两个因素也具有明显的纯二次效应。相互作用效应的大小与原始实验相似，但符号相反。同样，这很可能与以下事实有关：模型被拟合到因子空间中的更大范围。此处的相互作用效果未达到统计学意义，这可能是由于CCD析因部分的尺寸较小所致。在该实验中，只有四个观测值有助于估计相互作用。在原始的PB实验中，所有12个观察结果都是相关的。
Profiler（在图5中）对于“结合”这两个因素的线性和二次效应非常有帮助。我们可以看到，对于这两个因素，主导效应都是线性效应。估计的效果在整个实验区域都是单调的。在实验范围内，探查器将这两个因素设置为最佳设置，EE的估计水平等于46.9。二次效应表明，在每个因子的低水平下的影响都强于高水平。因此，较高的脂质浓度水平可能产生更高的EE，但边际效益却在下降。较低的药物浓度也会产生较高的EE，因此进一步降低剂量可能会带来可观的收益。当然，在进行超出实验范围的推断时，我们始终需要谨慎，任何使用更极端设置的建议都应在以后的实验中进行测试。
图6显示了基于CCD的预测EE水平的等高线图。高脂质浓度和低药物浓度可获得最高预测值。使用高脂质浓度可为实验中包括的所有药物浓度提供良好的预测值。
图5：CCD的探查器图
图6：使用来自CCD的模型预测的EE的等高线图
团队如何验证模型？
为了进一步测试预测EE的模型的有效性，研究小组进行了许多其他实验，改变了血脂浓度和药物浓度的设置。例如，1％和5％的药物浓度与30％至150％的几种脂质浓度相匹配。其中一些组合位于CCD中测试区域的边界。还测试了CCD域内的许多其他组合。结果表明，新数据与基于CCD的预测之间具有极好的一致性。
团队得出了什么结论？
研究团队使用实验得出了该项目中使用的特定活性成分的设计空间。他们相信，结论将是相当笼统的，并且将证明与许多其他亲水剂有关。因此，他们将这些实验视为开发用于许多其他设置的有效程序的跳板。关于低温存储的良好结果也令人鼓舞。他们表明，该产品可以在低温下保持稳定长达两年，而无需进行调整，这会使生产过程复杂化并增加生产成本。
本系列的下一篇
在QbD的背景下，本系列的下一篇博客文章将涵盖非线性设计，分割图设计和稳健设计。
参考文献
[1] Box，G. and Wilson，K.（1951），关于最佳条件的实验性获得，皇家统计学会杂志。系列B（方法论），第一卷13，第1号，第1至45页。
[2] Xu，X.，Khan，M. and Burgess，D.（2012），对含有亲水性API的脂质体的设计质量（QbD）案例研究：II。筛选关键变量，并建立实验室规模的设计空间，国际药物杂志，第423页，第543-553页。
