QbD 专栏：裂区实验编者注：这篇文章是由@龙克内特, @大卫_s和本尼·约斯科维奇的凯帕集团。 它是一系列博客文章的一部分，称为QbD 专栏。 有关作者的更多信息，请单击上面作者的社区名称。
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裂区实验是实验具有难以改变的因素，难以随机化并且只能在块级别应用。 一旦设定了难以改变的因素的水平，我们就可以用其他几个因素进行实验，以保持该水平固定。
为了说明这个想法，我们在这篇博文中引用了临床前研究 QbD（质量源自设计）实验的示例。 正如在第一篇文章在本系列中，QbD 涉及产品、流程和临床理解。 在这里，我们专注于通过应用实验设计方法来获得临床理解。
该实验在动物模型上比较了几种治疗严重慢性皮肤刺激的方法[1] 。 每次治疗都需要口服抗生素以及局部涂抹在受影响部位的乳膏。 有两种类型的抗生素，并在四种不同浓度的活性成分和三种计时策略下对乳膏进行了测试。
该实验使用四只实验动物进行，每只动物的背部从颈部以下有八个部位。 因此，这些地点被动物“封锁”。 对于每只动物，我们可以通过时间选项随机决定哪些部位应该用哪种浓度进行处理。 抗生素不同。 它们是口服的，因此每只动物只能获得一种抗生素，然后它将适用于该动物的所有部位。
该分析包括许多结果，最重要的是那些随着时间的推移跟踪受刺激区域的大小的结果，作为该部位初始大小的一部分。 总结随时间推移的改进的主要 CQA（关键质量属性）是曲线下面积[2] （AUC），这就是我们将在本博文中分析的响应。 AUC 是愈合率的总体衡量标准，当愈合快（慢）时，其值低（高）。
有关裂区实验的更多详细信息，一个很好的来源是Jones 和 Nachtsheim 的介绍性论文。
为什么裂区结构很重要？
在局部乳膏治疗研究中，动物组成实验组。 在数据分析中考虑区块的基本原因是，我们期望同一动物不同部位的结果彼此相似，但与其他动物部位的结果不同。 当我们比较时间和浓度时，我们利用了这一特性。 这些比较是在“动物内部”水平上进行的，这抵消了动物间的差异，从而提高了精度。 对于抗生素来说，动物之间的差异会影响我们的比较。 事实上，我们将每只动物视为一个整体，这意味着我们确实希望看到这种差异。 我们在设计实验和分析结果时都需要考虑到这一点。
什么是整体情节和次要情节？
我们使用术语“整体图”来指代块级单元，使用“子图”来指代嵌套在每个整体图内的单元。 在上面的例子中，动物作为整个地块，地点作为子地块。 这个术语可以追溯到 RA 爵士 费舍尔，实验统计设计的先驱。20 世纪初，费舍尔在英国洛桑的一个农业研究站工作。 该站的典型实验包括比较农作物类型、种植时间以及灌溉和施肥时间表。
费舍尔观察到，其中一些因素只能应用于大片土地，而其他因素则可以在更精细的空间分辨率下应用。 因此，对费舍尔来说，“整块地”是指大块土地，“子地块”是指构成整块土地的小块土地。 有些实验有两个以上的这样的水平。 如今，我们继续使用这些术语，尽管裂区影响了多种实验，而不仅仅是农业田间试验，而且“整体单元”和“子单元”通常不是土地。 在 QbD 背景下，它们由动物模型（如此处使用的示例）、材料批次或生产流程设置组成。
分裂图何时发生？
实验中裂区结构的可能来源有很多。 有时，如上所述，我们会对同一实验对象进行“重复测量”，但在不同的条件下。 有时，实验涉及多个难以设置为不同实验水平的因素，例如色谱柱或生物反应器温度。 在这种情况下，通常将难以改变的因素设置为一个水平，并在多次连续观察中将其保留在该水平，其中其他因素发生变化。 这导致了裂区实验，每次将难以改变的因子设置为新水平时都会有一个新的整体图。 有时，生产过程自然会导致这种嵌套。 例如，考虑一项提高生物药物蛋白质产量的实验。 该过程首先是在培养基中培养细胞；然后将细胞转移到培养板的孔中，在那里它们产生蛋白质。 实验可能包括一些影响生长期的因素和其他仅影响蛋白质生产的因素。 将烧瓶中的细胞分到几个不同的孔中可以在裂区水平上测试生产因子。
如何设计裂区实验？
定制设计工具联合管理计划可以轻松创建裂区设计。 首先，输入实验中的因素。 裂区结构是使用因子表中标记为“Changes”的列指定的。 可能的条目有“容易”、“困难”和“非常困难”，对应于因素之间的三个嵌套级别。 可以在单个观察级别分配的因素被声明为“简单”（默认设置）。 只能应用于观察块的因素被声明为“困难”。可能存在第三个级别，由仅适用于“块的块”的因素组成，并且这些因素被标记为“非常难”。图 1 显示了我们实验的因子表。 抗生素是难以改变的因素，因为它适用于动物，而不是个别部位。 时间和浓度是数值因素，因为该公司希望获得用于比较所考虑的所有水平的信息，而不需要通过回归模型进行推断。 因此，我们决定将所有因素声明为绝对因素。 请注意，浓度 0 表示使用基础霜时不添加所测试的化合物。 
图 1：实验的因子定义
下一步是指定任何特殊约束。 例如，某些因子组合可能无法测试，或者可能存在一些限制因子空间的不等式约束。 然后，您需要声明要估计哪些模型项，包括主效应和交互作用。 在我们的实验中，该公司想要估计这三个因素的主要影响。 他们想要有关两因素相互作用的信息，但认为这并不重要；然而，这个实验足够大，足以让我们估计所有这些项。 如果运行次数较少，我们可以通过单击这些术语的可估计性条目并选择“如果可能”选项来指示“所需但不重要”状态。 参见图 2。 
图 2：实验的模型定义
然后要求我们指定整块地块的数量，即可用动物的数量。在我们的研究中，有四种动物。 最后，我们需要指定运行次数。 定制设计工具建议默认样本大小，告诉我们可能的最小大小并允许我们指定大小。 在我们的实验中，可以在每只动物身上设置 8 个位点，总共 32 次运行。 单击“Make Design”按钮生成表 1 所示的设计。 有四个完整的地块，每种抗生素分配给其中的两个。 有 12 种时间和浓度的组合，但每只动物只有 8 个部位。 因此，有效选择将哪些治疗组合分配给每个地点非常重要。 而且，这个分配问题没有教科书上的解决方案。 在这种情况下，JMP 中的算法方法非常有用。 
表 1：四个完整地块中三个因素的 32 次试验设计，每个试验区有 8 次试验。 “抗生素”这个因素只能在“整个地块”层面上应用。
JMP 发现的设计对 12 个站点使用两小时时间方案，对 10 个站点使用其他方案。 每个浓度使用八次。 每个浓度计时选项可使用两次或三次。 （请注意，我们需要 36 次运行才能获得相同的组合重复，但实验只有 32 个位点。）设计自动包含“整体图”列 - 在我们的实验中，这告诉我们研究的是哪种动物，因此我们更改了该列的名称为“动物”。
裂区实验如何影响功效？
表 2 中的功耗分析具有指导意义。 我们发现时间和浓度因素的功效远高于抗生素。 功效较高是因为我们能够比较“动物体内”这些因素的水平，从而消除动物之间的任何差异。 另一方面，对于抗生素，比较受到动物之间差异的影响，因此相关样本量实际上是 4（动物数量）而不是 32（站点数量）。 
表 2：32 次运行设计的功耗分析
重要的是要认识到功耗分析必须做出一些假设。 其中包括因素影响的大小（预期系数）和方差的大小。表中的 RMSE 条目是针对站点到站点的变化。 还有一个关于“动物间”变异与“动物内”变异大小的假设。 默认假设是它们的大小大致相同。 如果您认为大部分变异存在于动物之间，则应将默认值更改为大于 1 的数字。 为此，请单击“自定义设计”旁边的红色小三角，选择“高级选项”链接，然后选择“裂区方差比”链接。
如何分析裂区实验？
该分析遵循与其他设计实验相同的一般结构；请参阅本系列之前的博客文章。 主要区别在于，我们需要将动物因素作为“随机效应”添加到设计中。正是这个随机效应项告诉 JMP 该实验是裂区实验。 使用“分析”下的“拟合模型”链接。 如果您从设计表中执行此操作，模型项列表将自动包含随机效应。 如果您以不同方式访问数据，则需要将 Animal 添加到模型效果列表中，并通过突出显示该术语并单击模型术语列表旁边的“属性”三角形将其声明为随机效果。 第一个选项是“随机效应”。
皮肤刺激实验发生了什么？
我们分析 AUC 的结果。有效的治疗组合的 AUC 值较低。 表 3 显示了评估这些因素是否具有显着影响的测试。 浓度有明显的影响（p 值=0.002）。 时间效应的 p 值为 0.076，因此表明存在效应，但比浓度效应弱得多。 用于比较两种抗生素的 F 统计量大于用于计时的 F 统计量。 然而，它的 p 值为 0.078，接近计时值。 原因是抗生素比较是在“整个图”水平上进行的，因此比时间策略和浓度的比较具有更多的不确定性和更低的功效。 
表3：效果测试
没有一个相互作用是强的。 因此，浓度显然是主导因素。 表 4 和图 3 总结了浓度对 AUC 的估计影响。 存在明显的关系，浓度越高，AUC 越低，因此愈合速度越快。 
表 4：四种浓度的估计平均 AUC
图 3：按浓度估计的平均 AUC 绘图
该分析包括“动物”的随机效应，反映了团队的信念，即部分变异存在于“动物间”水平。 表 5 显示了“动物内”（残差）和“动物间”方差的估计值。Var Component 列列出了估计方差分量：“动物内”水平为 0.0029，“动物间”水平为 0.0010。 第一列给出了动物间方差占“动物内”方差的比例，我们的实验估计约为 0.34。 
表 5：估计方差分量
有哪些值得带回家的信息？
外用乳膏研究提供了宝贵的信息，表明该乳膏在较高浓度下更有效。 每只动物使用多个部位可以对浓度和时间进行“动物内部”比较，因此可以在少量动物中发现增加浓度的积极效果。 “动物间”变异仅约为“动物内变异”的 1/3。这是一个惊喜，因为我们预计动物间会存在很大的差异。 当然，动物间变异的估计是基于非常小的样本，因此变化很大，因此在未来像这样的实验中，我们仍然会小心考虑裂区结构。 因此，必须通过动物而不是按部位施用的因子只有在具有非常强的效果或增加动物数量时才能被检测到。
即将到来的景点
本系列的下一篇文章将探讨 QbD 的应用，以使用部分因子和确定性筛选设计来设计分析方法。
参考
[1]有关测试局部皮肤病药物的更多信息，请参阅 FDA“行业指南”文件： http://www.fda.gov/ohrms/dockets/ac/00/backgrd/3661b1c.pdf [2]在示例中，我们使用所有除以最大 AUC 后归一化为 [0,1] 的数据。 [3]琼斯，B. 和纳茨海姆，C. (2009)。 裂区设计：什么、为什么和如何，《质量技术杂志》，41(4)，第 340-361 页。
裂区实验是实验具有难以改变的因素，难以随机化并且只能在块级别应用。
