L'avvento di scRNA-seq offre opportunità senza precedenti per esplorare i profili di espressione genica a livello di singola cellula. Attualmente, scRNA-seq è diventato una scelta preferita per lo studio delle questioni biologiche chiave dell'eterogeneità cellulare, specialmente negli studi di oncologia e immunologia. Tuttavia, pone anche nuove sfide nella visualizzazione dei dati e nell'analisi statistica a causa della sua elevata dimensionalità, scarsità, eterogeneità variabile tra le popolazioni cellulari, rumori tecnici e mancanza di riproducibilità.
Le tecnologie basate sul sequenziamento di nuova generazione per la genomica, la trascrittomica e l'epigenomica sono ora sempre più concentrate sulla caratterizzazione delle singole cellule. Il sequenziamento dell'RNA a cellula singola (scRNA-seq), ad esempio, può caratterizzare in modo completo i cambiamenti trascrizionali a livello cellulare e aiutare a comprendere meglio la funzione di una singola cellula nel contesto del suo microambiente. Di recente è stato utilizzato combattere COVID-19 caratterizzando i cambiamenti trascrizionali nelle singole cellule immunitarie.
Il flusso di lavoro scRNA-seq appena aggiunto in JMP Genomics 10 aiuta a esplorare visivamente e in modo interattivo popolazioni di cellule complesse e rare attraverso l'analisi dei cluster e quindi a rilevare i modelli di espressione genica differenziale tra i tipi di cellule e altre condizioni.
Perché JMP Genomics?
Nel JMP Genomics 10 , abbiamo creato un flusso di lavoro scRNA-seq standardizzato, interattivo e riproducibile per consentire agli scienziati di esplorare in modo efficiente i dati scRNA-seq con grande sicurezza. Le caratteristiche principali di questo flusso di lavoro includono controllo della qualità dei dati (QC), selezione di geni variabili, analisi SVD sparse, clustering, screening dell'importanza delle caratteristiche, visualizzazioni dinamiche (p. Es., Violin plot, ridgeline plot e dot plot), nonché analisi dell'espressione genica differenziale . Inoltre, utilizza la funzione di integrazione R in JMP per eseguire visualizzazioni t-SNE o UMAP sulle popolazioni di celle quando vengono installati i pacchetti R appropriati.
Caratteristiche principali
Questo articolo mostra le funzionalità chiave di questo nuovo flusso di lavoro analizzando un file Set di dati PBMC come esempio. Innanzitutto, dovrai utilizzare l'importatore di matrici Feature-Barcode situato nel file Importa> Sequenza di nuova generazione menu in JMP Genomics per leggere i dati di conteggio UMI non elaborati in formato sparse e quindi convertirli in formato denso. I dati di output dall'importatore possono quindi essere utilizzati come input per il flusso di lavoro di base RNA-seq a cellula singola trovato sotto il Flussi di lavoro> Di base sottomenu. Dopo aver specificato le impostazioni nell'interfaccia, fare clic su Correre per generare un report a schede organizzato in un progetto JMP.
Figura 1: interfaccia del flusso di lavoro ScRNA-Seq di base.
Panoramica dei dati e controllo di qualità
Il flusso di lavoro esegue i passaggi del controllo qualità per rimuovere cellule e geni di bassa qualità. Un rapporto di panoramica dei dati ti aiuterà a decidere quali criteri QC utilizzare. (Puoi esplorare questa visualizzazione e altre in questo post all'indirizzo JMP Public .)
Figura 2: rapporto di panoramica dei dati con le statistiche chiave di questo set di dati.
Selezione di geni variabili
Un modo per affrontare l'elevata dimensionalità e scarsità dei dati scRNA-seq è concentrarsi esclusivamente sui geni che mostrano un'elevata variazione da cellula a cellula. Per facilitare ciò, il flusso di lavoro offre due metodi di selezione del gene variabile, Dispersione e VST, per aiutarti a selezionare un set di geni altamente variabili per le analisi successive. La scheda Selezione gene variabile mostra un grafico della media della varianza con i geni variabili selezionati colorati in rosso.
Figura 3: Grafico della media della varianza del metodo VST. I punti rossi rappresentano i geni variabili selezionati; i geni rimanenti vengono scartati.
Analisi SVD sparse
Il flusso di lavoro esegue quindi un'analisi SVD sparsa per ridurre ulteriormente la dimensione e la scarsità del set di dati per scopi di clustering e visualizzazione. La scheda Clustering fornisce un grafico SVD 2D e 3D con i componenti principali per aiutarti a esplorare la struttura globale nei tuoi dati.
Figura 4: grafico 3D SVD che visualizza i primi tre componenti.
Clustering
Un compito importante nell'analisi dei dati scRNA-seq è l'identificazione delle popolazioni cellulari attraverso un algoritmo di clustering. Questo flusso di lavoro fornisce due algoritmi di clustering, gerarchico e K-means. In questo esempio, abbiamo utilizzato il clustering gerarchico, che ha identificato nove cluster nel set di dati PBMC. Puoi anche esplorare i cluster attraverso un dendrogramma o un diagramma di costellazioni.
Figura 5: Dendrogramma del raggruppamento gerarchico.
Figura 6: grafico delle costellazioni del raggruppamento gerarchico.
Visualizzazione UMAP e t-SNE
UMAP e t-SNE sono due metodi di visualizzazione popolari utilizzati nell'esplorazione dei dati scRNA-seq. JMP Genomics offre un'opzione per visualizzare i risultati del clustering con t-SNE e UMAP, a condizione che i pacchetti Rtsne e UMAP siano installati nell'ambiente R locale. JMP Genomics offre anche uno strumento chiamato Feature Switcher per aiutarti a passare in modo interattivo attraverso i modelli di espressione genica nelle visualizzazioni t-SNE e UMAP senza generare dozzine di cifre sul tuo disco rigido. Nella Figura 7, utilizzo UMAP come esempio.
Figura 7: visualizzazione UMAP con filtro dati locale e funzione Switcher
Più visualizzazioni
JMP Genomics offre inoltre strumenti di visualizzazione aggiuntivi che consentono di esplorare dinamicamente e in modo interattivo i modelli di espressione genica tra i tipi di cellule, inclusi i grafici del violino, i grafici delle creste e i grafici a punti. Gli utenti possono definire le popolazioni cellulari in base al modello di espressione di un elenco di geni marker tramite un pulsante Recode. Inoltre, gli utenti possono controllare le informazioni sui geni di interesse tramite collegamenti a database esterni.
Figura 8: grafico del violino, grafico della cresta e grafico a punti dei livelli di espressione genica tra i tipi di cellule.
Screening dell'importanza delle funzionalità
Sebbene la fase di selezione del gene variabile abbia ridotto significativamente il numero di geni nelle analisi, ci sono ancora migliaia di geni da esplorare. Pertanto, JMP Genomics offre un metodo di screening delle funzionalità utilizzando un algoritmo di foresta bootstrap per classificare i geni in base alla loro importanza nella separazione cellulare. Gli utenti possono selezionare, ad esempio, i primi 30 geni per la visualizzazione invece di 2.000. JMP Genomics fornisce anche uno strumento che aiuta a inviare questo elenco di geni importanti al database GTEx per esplorare i loro modelli di espressione specifici del tessuto.
Figura 9: rapporto di screening delle caratteristiche che mostra i primi 30 geni.
Espressione genica differenziale
L'analisi dell'espressione genica differenziale è un passaggio chiave per ricavare informazioni statistiche sui cambiamenti trascrizionali tra i tipi di cellule dai dati scRNA-seq. Questo flusso di lavoro integra la piattaforma ANOVA in JMP Genomics per eseguire analisi di espressione genica differenziale utilizzando un sofisticato modello a effetti misti che consente progetti di studio complicati.
Iniziare
Questo video introduttivo di cinque minuti su questo nuovo flusso di lavoro RNA-seq a cellula singola ti consentirà di iniziare.
Maggiori informazioni
Poiché scRNA-seq continua a guadagnare popolarità nella ricerca biomedica, è necessario un flusso di lavoro riproducibile, interattivo e di facile utilizzo per estrarre rapidamente informazioni valide dai set di dati scRNA-seq in rapida crescita. Il nuovo flusso di lavoro scRNA-seq in JMP Genomics 10 ti consente di accelerare la tua ricerca importante con maggiore comodità e sicurezza. Inoltre, JMP Genomics 10 è più potente che mai, traendo vantaggio dalla piattaforma avanzata di modellazione predittiva in JMP Pro e fornendo una migliore integrazione con i pacchetti open source in R e Python. Vai a JMP Genomics per maggiori informazioni.
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