Das Aufkommen von scRNA-seq bietet beispiellose Möglichkeiten zur Erforschung von Genexpressionsprofilen auf Einzelzellenebene. Gegenwärtig ist scRNA-seq eine bevorzugte Wahl für die Untersuchung der wichtigsten biologischen Fragen der Zellheterogenität, insbesondere in onkologischen und immunologischen Studien. Aufgrund seiner hohen Dimensionalität, Sparsamkeit, unterschiedlichen Heterogenität zwischen Zellpopulationen, technischen Geräuschen und mangelnder Reproduzierbarkeit stellt es jedoch auch neue Herausforderungen bei der Datenvisualisierung und statistischen Analyse.
Sequenzierungsbasierte Technologien der nächsten Generation für Genomik, Transkriptomik und Epigenomik konzentrieren sich nun zunehmend auf die Charakterisierung einzelner Zellen. Beispielsweise kann die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) Transkriptionsänderungen auf zellulärer Ebene umfassend charakterisieren und dazu beitragen, die Funktion einer einzelnen Zelle im Kontext ihrer Mikroumgebung besser zu verstehen. Vor kurzem wurde es verwendet Kampf COVID-19 durch Charakterisierung von Transkriptionsänderungen in einzelnen Immunzellen.
Der neu hinzugefügte scRNA-seq-Workflow in JMP Genomics 10 hilft Ihnen, komplexe und seltene Zellpopulationen durch Clusteranalyse visuell und interaktiv zu untersuchen und dann die unterschiedlichen Genexpressionsmuster über Zelltypen und andere Bedingungen hinweg zu erkennen.
Warum JMP Genomics?
Im JMP Genomics 10 Wir haben einen standardisierten, interaktiven und reproduzierbaren scRNA-seq-Workflow erstellt, mit dem Wissenschaftler ihre scRNA-seq-Daten mit großer Sicherheit effizient untersuchen können. Zu den Hauptmerkmalen dieses Workflows gehören die Datenqualitätskontrolle (QC), die variable Genselektion, die spärliche SVD-Analyse, das Clustering, das Screening der Merkmalsbedeutung, dynamische Visualisierungen (z. B. Geigenplot, Ridgeline-Plot und Punktdiagramm) sowie die Analyse der differentiellen Genexpression . Darüber hinaus wird die R-Integrationsfunktion in JMP verwendet, um t-SNE- oder UMAP-Visualisierungen für die Zellpopulationen durchzuführen, wenn geeignete R-Pakete installiert werden.
Hauptmerkmale
Dieser Artikel zeigt Ihnen die wichtigsten Funktionen dieses neuen Workflows anhand der Analyse von a PBMC-Datensatz als Beispiel. Zunächst müssen Sie den Importer für Feature-Barcode-Matrizen verwenden, der sich in der Importieren> Next-Gen-Sequenzierung Menü in JMP Genomics, um die UMI-Rohdaten im Sparse-Format einzulesen und anschließend in ein dichtes Format zu konvertieren. Die Ausgabedaten des Importeurs können dann als Eingabe für den grundlegenden Einzelzell-RNA-seq-Workflow verwendet werden, der unter dem zu finden ist Workflows> Basic Untermenü. Klicken Sie nach dem Festlegen der Einstellungen in der Benutzeroberfläche auf Lauf um einen in einem JMP-Projekt organisierten Bericht mit Registerkarten zu generieren.
Abbildung 1: Schnittstelle des grundlegenden ScRNA-Seq-Workflows.
Datenübersicht und Qualitätskontrolle
Der Workflow führt QC-Schritte durch, um Zellen und Gene von geringer Qualität zu entfernen. Ein Datenübersichtsbericht hilft Ihnen bei der Entscheidung, welche QC-Kriterien verwendet werden sollen. (Sie können diese und andere Visualisierungen in diesem Beitrag unter erkunden JMP Public .)
Abbildung 2: Datenübersichtsbericht mit Schlüsselstatistiken dieses Datensatzes.
Variable Genselektion
Eine Möglichkeit, mit der hohen Dimensionalität und Sparsamkeit in scRNA-seq-Daten umzugehen, besteht darin, sich ausschließlich auf Gene zu konzentrieren, die eine hohe Variation von Zelle zu Zelle aufweisen. Um dies zu vereinfachen, bietet der Workflow zwei Methoden zur variablen Genselektion, Dispersion und VST, mit denen Sie eine Reihe hochvariabler Gene für nachfolgende Analysen auswählen können. Die Registerkarte Variable Gene Selection zeigt Ihnen ein Varianz-Mittelwert-Diagramm mit den ausgewählten variablen Genen, die rot gefärbt sind.
Abbildung 3: Varianz-Mittelwert-Diagramm der VST-Methode. Rote Punkte stehen für ausgewählte variable Gene. Die restlichen Gene werden verworfen.
Sparse SVD-Analyse
Der Workflow führt dann eine spärliche SVD-Analyse durch, um die Dimension und Sparsamkeit des Datensatzes für Clustering- und Visualisierungszwecke weiter zu reduzieren. Die Registerkarte "Clustering" enthält sowohl ein 2D- als auch ein 3D-SVD-Diagramm mit Top-Komponenten, mit denen Sie die globale Struktur Ihrer Daten untersuchen können.
Abbildung 4: 3D-SVD-Diagramm zur Visualisierung der drei wichtigsten Komponenten.
Clustering
Eine wichtige Aufgabe bei der scRNA-seq-Datenanalyse ist die Identifizierung von Zellpopulationen durch einen Clustering-Algorithmus. Dieser Workflow bietet zwei Clustering-Algorithmen, hierarchische und K-Mittelwerte. In diesem Beispiel haben wir hierarchisches Clustering verwendet, bei dem neun Cluster im PBMC-Datensatz identifiziert wurden. Sie können Cluster auch durch ein Dendrogramm oder ein Konstellationsdiagramm untersuchen.
Abbildung 5: Dendrogramm der hierarchischen Clusterbildung
Abbildung 6: Konstellationsdiagramm der hierarchischen Clusterbildung.
UMAP- und t-SNE-Visualisierung
UMAP und t-SNE sind zwei beliebte Visualisierungsmethoden, die bei der Erforschung von scRNA-seq-Daten verwendet werden. JMP Genomics bietet eine Option zur Visualisierung Ihres Clustering-Ergebnisses mit t-SNE und UMAP, sofern Sie die Rtsne- und UMAP-Pakete in Ihrer lokalen R-Umgebung installiert haben. JMP Genomics bietet auch ein Tool namens Feature Switcher, mit dem Sie Genexpressionsmuster in t-SNE- und UMAP-Visualisierungen interaktiv durchgehen können, ohne Dutzende von Zahlen auf Ihrer Festplatte zu generieren. In Abbildung 7 verwende ich UMAP als Beispiel.
Abbildung 7: UMAP-Visualisierung mit lokalem Datenfilter und Feature Switcher
Weitere Visualisierungen
JMP Genomics bietet außerdem zusätzliche Visualisierungstools, mit denen Sie Genexpressionsmuster über Zelltypen hinweg dynamisch und interaktiv untersuchen können, einschließlich Geigen-, Kammlinien- und Punktdiagrammen. Benutzer können Zellpopulationen basierend auf dem Expressionsmuster einer Liste von Markergenen über eine Schaltfläche zum erneuten Codieren definieren. Darüber hinaus können Benutzer Informationen zu interessierenden Genen über Links zu externen Datenbanken überprüfen.
8: Violinplot, Ridgeline-Plot und Punktdiagramm der Genexpressionsniveaus über Zelltypen hinweg.
Funktions-Wichtigkeits-Screening
Obwohl der variable Genselektionsschritt die Anzahl der Gene in den Analysen signifikant reduzierte, müssen noch Tausende von Genen untersucht werden. Daher bietet JMP Genomics eine Feature-Screening-Methode an, bei der ein Bootstrap-Forest-Algorithmus verwendet wird, um die Gene anhand ihrer Bedeutung für die Zelltrennung zu klassifizieren. Benutzer können beispielsweise anstelle von 2.000 die 30 besten Gene für die Visualisierung auswählen. JMP Genomics bietet auch ein Tool, mit dem diese Liste wichtiger Gene an die GTEx-Datenbank gesendet werden kann, um ihre gewebespezifischen Expressionsmuster zu untersuchen.
Abbildung 9: Feature-Screening-Bericht mit den 30 wichtigsten Genen.
Differenzielle Genexpression
Die Analyse der differentiellen Genexpression ist ein wichtiger Schritt, um statistische Erkenntnisse über Transkriptionsänderungen zwischen Zelltypen aus scRNA-seq-Daten abzuleiten. Dieser Workflow integriert die ANOVA-Plattform in JMP Genomics, um eine differentielle Genexpressionsanalyse unter Verwendung eines ausgeklügelten Mischeffektmodells durchzuführen, das komplizierte Studiendesigns ermöglicht.
Beginnen
Dieses fünfminütige Einführungsvideo zu diesem neuen Einzelzell-RNA-seq-Workflow wird Ihnen den Einstieg erleichtern.
Mehr Informationen
Da scRNA-seq in der biomedizinischen Forschung immer beliebter wird, ist ein reproduzierbarer, interaktiver und benutzerfreundlicher Workflow erforderlich, um schnell gültige Erkenntnisse aus den schnell wachsenden scRNA-seq-Datensätzen zu extrahieren. Mit dem neuen scRNA-seq-Workflow in JMP Genomics 10 können Sie Ihre wichtige Forschung bequemer und sicherer beschleunigen. Darüber hinaus ist JMP Genomics 10 leistungsfähiger als je zuvor. Es nutzt die erweiterte Plattform für die prädiktive Modellierung in JMP Pro und bietet eine bessere Integration mit Open Source-Paketen in R und Python. Gehe zu JMP Genomics für mehr Informationen.
Lesen Sie unbedingt die folgenden Präsentationen zum scRNA-seq-Workflow und anderen aufregenden Funktionen in JMP Genomics:
