El advenimiento de scRNA-seq brinda oportunidades sin precedentes para explorar los perfiles de expresión génica a nivel de una sola célula. Actualmente, scRNA-seq se ha convertido en una opción preferida para estudiar las cuestiones biológicas clave de la heterogeneidad celular, especialmente en estudios de oncología e inmunología. Sin embargo, también plantea nuevos desafíos en la visualización de datos y el análisis estadístico debido a su alta dimensionalidad, escasez, heterogeneidad variable entre las poblaciones de células, ruidos técnicos y falta de reproducibilidad.
Las tecnologías basadas en secuenciación de próxima generación para genómica, transcriptómica y epigenómica se centran ahora cada vez más en la caracterización de células individuales. La secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq), por ejemplo, puede caracterizar de manera integral los cambios transcripcionales a nivel celular y ayudar a comprender mejor la función de una célula individual en el contexto de su microambiente. Recientemente, se ha utilizado para combate COVID-19 caracterizando cambios transcripcionales en células inmunes individuales.
El flujo de trabajo scRNA-seq recién agregado en JMP Genomics 10 lo ayuda a explorar de forma visual e interactiva poblaciones de células complejas y raras a través del análisis de agrupamiento y luego detectar los patrones de expresión génica diferencial entre tipos de células y otras condiciones.
¿Por qué JMP Genomics?
En JMP Genomics 10 , creamos un flujo de trabajo de scRNA-seq estandarizado, interactivo y reproducible para que los científicos exploren de manera eficiente sus datos de scRNA-seq con gran confianza. Las características clave de este flujo de trabajo incluyen control de calidad de datos (QC), selección de genes variables, análisis de SVD disperso, agrupamiento, detección de importancia de características, visualizaciones dinámicas (por ejemplo, gráfico de violín, gráfico de líneas de cresta y gráfico de puntos), así como análisis de expresión genética diferencial . Además, utiliza la función de integración R en JMP para realizar visualizaciones t-SNE o UMAP en las poblaciones de células cuando se instalan los paquetes R adecuados.
Características clave
Este artículo le muestra las características clave de este nuevo flujo de trabajo analizando un Conjunto de datos PBMC como ejemplo. Primero, necesitará utilizar el importador de matrices Feature-Barcode ubicado en el Importar> Secuenciación de próxima generación en JMP Genomics para leer los datos de recuento de UMI sin procesar en formato disperso y luego convertirlos a formato denso. Los datos de salida del importador se pueden utilizar como entrada para el flujo de trabajo básico de RNA-seq de celda única que se encuentra en Flujos de trabajo> Básico submenú. Después de especificar la configuración en la interfaz, haga clic en correr para generar un informe con pestañas organizado en un proyecto JMP.
Figura 1: Interfaz del flujo de trabajo básico de ScRNA-Seq.
Resumen de datos y control de calidad
El flujo de trabajo realiza pasos de CC para eliminar células y genes de baja calidad. Un informe de resumen de datos le ayudará a decidir qué criterios de control de calidad utilizar. (Puede explorar esta visualización y otras en esta publicación en JMP Público .)
Figura 2: Informe de resumen de datos con estadísticas clave de este conjunto de datos.
Selección de genes variables
Una forma de lidiar con la alta dimensionalidad y escasez en los datos de scRNA-seq es enfocarse únicamente en genes que exhiben una alta variación de célula a célula. Para facilitar esto, el flujo de trabajo ofrece dos métodos de selección de genes variables, Dispersión y VST, para ayudarlo a seleccionar un conjunto de genes altamente variables para análisis posteriores. La pestaña Selección de genes variables muestra una gráfica de la media de la varianza con los genes variables seleccionados de color rojo.
Figura 3: Gráfico de varianza-media del método VST. Los puntos rojos representan genes variables seleccionados; los genes restantes se descartan.
Análisis de SVD disperso
Luego, el flujo de trabajo realiza un análisis de SVD disperso para reducir aún más la dimensión y la escasez del conjunto de datos para fines de agrupación y visualización. La pestaña de agrupamiento proporciona un gráfico SVD en 2D y 3D con componentes superiores para ayudarlo a explorar la estructura global en sus datos.
Figura 4: Gráfico 3D SVD que visualiza los tres componentes principales.
Agrupación
Una tarea importante en el análisis de datos de scRNA-seq es identificar poblaciones de células a través de un algoritmo de agrupamiento. Este flujo de trabajo proporciona dos algoritmos de agrupamiento, jerárquico y K-medias. En este ejemplo, usamos agrupación jerárquica, que identificó nueve agrupaciones en el conjunto de datos de PBMC. También puede explorar grupos a través de un dendrograma o un diagrama de constelación.
Figura 5: Dendrograma de agrupamiento jerárquico.
Figura 6: Gráfico de constelación de agrupamiento jerárquico.
Visualización UMAP y t-SNE
UMAP y t-SNE son dos métodos de visualización populares utilizados en la exploración de datos scRNA-seq. JMP Genomics ofrece una opción para visualizar el resultado de su agrupación en clústeres con t-SNE y UMAP siempre que tenga los paquetes Rtsne y UMAP instalados en su entorno R local. JMP Genomics también ofrece una herramienta llamada Feature Switcher para ayudarlo a recorrer de forma interactiva patrones de expresión genética en visualizaciones t-SNE y UMAP sin generar docenas de figuras en su disco duro. En la Figura 7, utilizo UMAP como ejemplo.
Figura 7: Visualización UMAP con filtro de datos local y selector de funciones
Más visualizaciones
JMP Genomics también ofrece herramientas de visualización adicionales que le permiten explorar de forma dinámica e interactiva los patrones de expresión génica en todos los tipos de células, incluidas las gráficas de violín, las gráficas de crestas y las gráficas de puntos. Los usuarios pueden definir poblaciones de células basándose en el patrón de expresión de una lista de genes marcadores mediante un botón Recode. Además, los usuarios pueden consultar información sobre genes de interés a través de enlaces a bases de datos externas.
Figura 8: Gráfico de violín, gráfico de crestas y gráfico de puntos de los niveles de expresión génica en los tipos de células.
Detección de importancia de características
Aunque el paso de selección de genes variables redujo significativamente el número de genes en los análisis, todavía quedan miles de genes por explorar. Por lo tanto, JMP Genomics ofrece un método de detección de características que utiliza un algoritmo de bosque de arranque para clasificar los genes en función de su importancia en la separación celular. Los usuarios pueden seleccionar, por ejemplo, los 30 genes principales para visualización en lugar de 2000. JMP Genomics también proporciona una herramienta que ayuda a enviar esta lista de genes importantes a la base de datos GTEx para explorar sus patrones de expresión específicos de tejido.
Figura 9: Informe de detección de características que muestra los 30 genes principales.
Expresión genética diferencial
El análisis diferencial de la expresión génica es un paso clave para obtener conocimientos estadísticos sobre los cambios transcripcionales en los tipos de células a partir de los datos de scRNA-seq. Este flujo de trabajo integra la plataforma ANOVA en JMP Genomics para realizar análisis de expresión genética diferencial utilizando un modelo sofisticado de efectos mixtos que permite diseños de estudio complicados.
Empezando
Este video introductorio de cinco minutos sobre este nuevo flujo de trabajo de RNA-seq unicelular lo ayudará a comenzar.
Más información
A medida que scRNA-seq continúa ganando popularidad en la investigación biomédica, se necesita un flujo de trabajo reproducible, interactivo y fácil de usar para extraer rápidamente información válida de los conjuntos de datos de scRNA-seq en rápido crecimiento. El nuevo flujo de trabajo scRNA-seq en JMP Genomics 10 le permite acelerar su importante investigación con mayor comodidad y confianza. Además, JMP Genomics 10 es más poderoso que nunca, aprovecha la plataforma mejorada de modelado predictivo en JMP Pro y brinda una mejor integración con paquetes de código abierto en R y Python. Ir JMP Genomics para más información.
Asegúrese de consultar las siguientes presentaciones sobre el flujo de trabajo de scRNA-seq y otras funciones interesantes de JMP Genomics:
