L'avènement de scRNA-seq offre des opportunités sans précédent pour explorer les profils d'expression génique au niveau unicellulaire. Actuellement, scRNA-seq est devenu un choix privilégié pour étudier les principales questions biologiques de l'hétérogénéité cellulaire, en particulier dans les études en oncologie et en immunologie. Cependant, il pose également de nouveaux défis dans la visualisation des données et l'analyse statistique en raison de sa dimensionnalité élevée, de sa rareté, de l'hétérogénéité variable entre les populations de cellules, des bruits techniques et du manque de reproductibilité.
Les technologies de nouvelle génération basées sur le séquençage pour la génomique, la transcriptomique et l'épigénomique sont désormais de plus en plus axées sur la caractérisation de cellules individuelles. Le séquençage d'ARN unicellulaire (scRNA-seq), par exemple, peut caractériser de manière exhaustive les changements transcriptionnels au niveau cellulaire et aider à mieux comprendre la fonction d'une cellule individuelle dans le contexte de son microenvironnement. Récemment, il a été utilisé pour combat COVID-19 en caractérisant les changements transcriptionnels dans les cellules immunitaires individuelles.
Le flux de travail scRNA-seq nouvellement ajouté dans JMP Genomics 10 vous aide à explorer visuellement et de manière interactive des populations de cellules complexes et rares grâce à une analyse de regroupement, puis à détecter les modèles d'expression génique différentiels entre les types de cellules et d'autres conditions.
Pourquoi JMP Genomics?
Dans JMP Genomics 10 , nous avons créé un flux de travail scRNA-seq standardisé, interactif et reproductible pour que les scientifiques puissent explorer efficacement leurs données scRNA-seq en toute confiance. Les principales caractéristiques de ce flux de travail incluent le contrôle de la qualité des données (CQ), la sélection de gènes variables, l'analyse SVD clairsemée, le regroupement, le criblage de l'importance des caractéristiques, les visualisations dynamiques (par exemple, tracé de violon, tracé de ligne de crête et tracé de points), ainsi que l'analyse différentielle de l'expression des gènes . En outre, il utilise la fonction d'intégration R dans JMP pour effectuer des visualisations t-SNE ou UMAP sur les populations de cellules lorsque les packages R appropriés sont installés.
Principales caractéristiques
Cet article vous présente les principales fonctionnalités de ce nouveau flux de travail en analysant un Ensemble de données PBMC par exemple. Tout d'abord, vous devrez utiliser l'importateur de matrices Feature-Barcode situé dans le Importer> Séquençage nouvelle génération dans JMP Genomics pour lire les données de comptage UMI brutes au format fragmenté, puis les convertir en format dense. Les données de sortie de l'importateur peuvent ensuite être utilisées comme entrée pour le flux de travail de base d'ARN-seq monocellulaire situé sous le Flux de travail> Basique sous-menu. Après avoir spécifié les paramètres dans l'interface, cliquez sur Courir pour générer un rapport à onglets organisé dans un projet JMP.
Figure 1: Interface du flux de travail ScRNA-Seq de base.
Aperçu des données et CQ
Le flux de travail effectue des étapes de contrôle qualité pour éliminer les cellules et les gènes de mauvaise qualité. Un rapport de synthèse des données vous aidera à choisir les critères de contrôle qualité à utiliser. (Vous pouvez explorer cette visualisation et d'autres dans cet article à Public JMP .)
Figure 2: Rapport de synthèse des données avec les statistiques clés de cet ensemble de données.
Sélection de gènes variables
Une façon de gérer la dimensionnalité élevée et la rareté des données scRNA-seq est de se concentrer uniquement sur les gènes qui présentent une forte variation de cellule à cellule. Pour faciliter cela, le flux de travail propose deux méthodes de sélection de gènes variables, Dispersion et VST, pour vous aider à sélectionner un ensemble de gènes hautement variables pour les analyses ultérieures. L'onglet Variable Gene Selection vous montre un graphique de la moyenne de la variance avec les gènes variables sélectionnés colorés en rouge.
Figure 3: Diagramme de variance-moyenne de la méthode VST. Les points rouges représentent des gènes variables sélectionnés; les gènes restants sont rejetés.
Analyse SVD parcellaire
Le flux de travail effectue ensuite une analyse SVD clairsemée pour réduire davantage la dimension et la rareté de l'ensemble de données à des fins de clustering et de visualisation. L'onglet de regroupement fournit à la fois un tracé SVD 2D et 3D avec les principaux composants pour vous aider à explorer la structure globale de vos données.
Figure 4: tracé SVD 3D visualisant les trois principaux composants.
Clustering
Une tâche importante dans l'analyse des données scRNA-seq consiste à identifier les populations de cellules grâce à un algorithme de regroupement. Ce flux de travail fournit deux algorithmes de clustering, hiérarchique et K-means. Dans cet exemple, nous avons utilisé le regroupement hiérarchique, qui a identifié neuf groupes dans l'ensemble de données PBMC. Vous pouvez également explorer les clusters via un dendrogramme ou un graphique de constellation.
Figure 5: Dendrogramme du regroupement hiérarchique.
Figure 6: Graphique de constellation du regroupement hiérarchique.
Visualisation UMAP et t-SNE
UMAP et t-SNE sont deux méthodes de visualisation populaires utilisées dans l'exploration de données scRNA-seq. JMP Genomics offre une option pour visualiser le résultat de votre clustering avec t-SNE et UMAP à condition que les packages Rtsne et UMAP soient installés dans votre environnement R local. JMP Genomics propose également un outil appelé Feature Switcher pour vous aider à parcourir de manière interactive les modèles d'expression génique dans les visualisations t-SNE et UMAP sans générer des dizaines de chiffres sur votre disque dur. Dans la figure 7, j'utilise UMAP comme exemple.
Figure 7: visualisation UMAP avec filtre de données local et sélecteur de fonctionnalités
Plus de visualisations
JMP Genomics propose également des outils de visualisation supplémentaires vous permettant d'explorer de manière dynamique et interactive les modèles d'expression génique à travers les types de cellules, y compris les graphiques de violon, les graphiques de lignes de crête et les graphiques de points. Les utilisateurs peuvent définir des populations de cellules en fonction du modèle d'expression d'une liste de gènes marqueurs via un bouton Recoder. En outre, les utilisateurs peuvent vérifier les informations sur les gènes d'intérêt via des liens vers des bases de données externes.
Figure 8: Graphique de violon, graphique de ligne de crête et graphique de points des niveaux d'expression génique à travers les types de cellules.
Vérification de l'importance des fonctionnalités
Bien que l'étape de sélection variable des gènes ait considérablement réduit le nombre de gènes dans les analyses, il reste encore des milliers de gènes à explorer. Par conséquent, JMP Genomics propose une méthode de sélection des fonctionnalités utilisant un algorithme de forêt bootstrap pour classer les gènes en fonction de leur importance dans la séparation cellulaire. Les utilisateurs peuvent sélectionner, par exemple, les 30 meilleurs gènes pour la visualisation au lieu de 2000. JMP Genomics fournit également un outil qui permet d'envoyer cette liste de gènes importants à la base de données GTEx pour explorer leurs modèles d'expression spécifiques aux tissus.
Figure 9: Rapport de sélection des fonctionnalités montrant les 30 principaux gènes.
Expression génique différentielle
L'analyse de l'expression différentielle des gènes est une étape clé pour obtenir des informations statistiques sur les changements transcriptionnels à travers les types de cellules à partir des données scRNA-seq. Ce flux de travail intègre la plate-forme ANOVA dans JMP Genomics pour effectuer une analyse d'expression génique différentielle à l'aide d'un modèle sophistiqué à effets mixtes qui permet des conceptions d'études complexes.
Commencer
Cette vidéo d'introduction de cinq minutes sur ce nouveau flux de travail RNA-seq monocellulaire vous permettra de démarrer.
Plus d'information
Alors que scRNA-seq continue de gagner en popularité dans la recherche biomédicale, un flux de travail reproductible, interactif et convivial est nécessaire pour extraire rapidement des informations valides à partir des ensembles de données scRNA-seq en croissance rapide. Le nouveau flux de travail scRNA-seq de JMP Genomics 10 vous permet d'accélérer vos recherches importantes avec plus de commodité et de confiance. De plus, JMP Genomics 10 est plus puissant que jamais, tirant parti de la plate-forme de modélisation prédictive améliorée de JMP Pro et offrant une meilleure intégration avec les packages open source en R et Python. Aller à Génomique JMP pour plus d'informations.
N'oubliez pas de consulter les présentations suivantes sur le flux de travail scRNA-seq et d'autres fonctionnalités intéressantes de JMP Genomics:
