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使用 JMP® 專案建立單細胞 RNA 定序工作流程 (2020-US-30MP-603)

等級：中級

 

Meijianguan，JMP 研究統計師開發人員，SAS

 

單細胞 RNA 定序技術 (scRNA-seq) 可提供更高解析度的細胞差異，並更了解單一細胞在其微環境中的功能。 最近，它已被用於透過表徵個體免疫細胞的轉錄變化來對抗 COVID-19。 然而，由於其高維度、稀疏性和不同細胞群的異質性，它也為數據視覺化和分析帶來了新的挑戰。 JMP Project 是一種組織資料表、報告、腳本以及外部文件的新方法。 在本示範中，我將展示如何使用 JMP Project 建立整合的基本 scRNA-seq 工作流程，對 scRNA-seq 資料集執行標準探索。 它首先使用分散或方差穩定變換（VST）方法選擇一組高變異基因。 然後透過執行稀疏 SVD 分析進一步降低資料維度和稀疏性。 然後，它會產生一份互動式報告，其中包括數據概述、可變基因圖、層次聚類、特徵重要性篩選和單一基因表現水平的動態小提琴圖。 此外，如果安裝了適當的 R 軟體包，它還利用 JMP 中的 R 整合功能對細胞群執行 t-SNE 或 UMAP 視覺化。

 

 

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揚聲器	成績單
關美健	好的。 嗯，大家好。 非常感謝您參加這次演講。 我很高興有這個機會分享我的工作
	一直與 JMP 生命科學集團和 SAS 研究所合作。 今天的主題是使用 JMP Project 建立單細胞 RNA 定序工作流程。 這是我為 JMP Genomics 10 開發的新功能。 如果您不知道什麼是 JMP Genomics，我將向您簡單介紹一下
	關於它的概述和JMP專案是一個新功能，於14日發布，它是一個非常好的工具，可以幫助您組織報告。 所以我們利用這個新平台組織了一個單細胞RNA定序
	工作流程進入其中。 首先，我想向您介紹 JMP 的背景知識，JMP Genomics 是
	JMP 系列產品之一是基於 SAS 和 JMP Pro 建置。 因此，它利用了這兩種產品，從而形成了非常強大的分析工具。
	所以它是為基因組數據設計的，所以它可以讀取不同類型的基因組數據，它可以進行預處理，它可以處理下一代定序分析。
	它非常擅長差異基因表現和生物標記發現，許多科學家將其用於農作物和牲畜育種。 所以它是一個非常強大的工具。 如果你正在做任何與基因組學相關的事情，我鼓勵每個人都檢查一下。
	接下來我想跟大家分享的是單細胞RNA定序。 很多人可能對它不太熟悉。
	因此，這是一項相對較新的技術，用於在單一細胞的層面上進行檢查。
	並與傳統的RNA定序技術所測量的一組細胞的平均表現量進行比較。
	這項新技術提供了更高解析度的細胞差異，讓您更了解單一細胞在其微環境中的功能。
	它可以幫助做很多事情，例如發現新的和稀有的細胞群，追蹤細胞發育的軌跡，以及識別細胞類型之間差異表達的基因。 所以它的應用非常廣泛。
	最近的應用程式之一是科學家用它來對抗 Covid 19，因為它可以用來
	描述免疫細胞轉錄變化的特徵以及如何開發疫苗和治療方法。 除此之外，它也廣泛應用於癌症研究、免疫學和許多其他研究領域。 嗯，所以它是非常強大的工具，但是
	分析這些數據確實面臨一些挑戰，所以這就是我們整合這個工作流程的原因。
	只是想向您概述單細胞 RNA 定序的要點。 所以你需要做的第一件事就是取得樣品，
	來自人類或動物。 它可能是腫瘤或實驗室樣本。 然後您可以將這些樣本分離到單一細胞。
	因此，分離後，您可以對每個細胞的所有基因進行定序。 例如，人類大約有 30,000 個基因。 所以最終的產品在我們的閱讀計數表中將如下所示。 我們有基因...30,000 個基因排成一行，我們有
	有時大約有五十萬個細胞作為列。 所以正如你所看到的，滿足這些非常大的資料集具有非常高的維度。 您也可以注意到表中的零，因為
	由於技術或生物學的限制，我們無法檢測每個細胞中的每個基因。 因此，90% 的細胞實際上是
	零。所以它非常稀疏。 分析單細胞 RNA 定序資料時，稀疏性是另一個挑戰。
	但是，在進行預處理、清理和降維之後，您可以對該數據應用常規分析（例如聚類和主成分、差異基因表現分析）。 所以這些會在我的工作流程中提到。
	我已經提到過，我注意到了挑戰，包括高維度、高稀疏性，以及細胞群體之間存在不同的異質性。
	技術雜訊和重現性，因為有這麼多不同的定序方案，有這麼多不同的分析套件。
	在 R 或 Python 或其他工具中，您很難按照準確的步驟來分析資料。 如果你混淆了步驟並且沒有按照正確的順序做事，
	您可能無法獲得可重複的結果。 這就是我們試圖解決的問題之一。
	只是想向您展示一個單細胞 RNA 定序資料的範例。 這些數據將在我的演示中使用，它是減少的血液樣本數據或 ppm。 看到我說我們有行中的細胞和列中的基因，所以它是
	約8000列和100
	行，這意味著單元格。 你幾乎到處都可以看到這些零。 我，我相信這個特定資料集中有超過 90% 的稀疏性。
	那麼 JMP Genomics 10 中新的單細胞 RNA 定序工作流程有哪些內容呢？ 所以對於這個工作流程，我們嘗試建立它
	對於那些沒有很好的技術背景或沒有很好的人來說，沒有時間學習如何編碼和所有這些統計數據。 因此，在此工作流程中，我們將這些步驟依照正確的順序排列，以便使用者自動執行工作流程中的其他步驟。 而我們也
	提供互動性很強的報告，幫助使用者與我們一起導航、更改參數並檢查不同的選擇。
	那麼這個工作流程中包含資料導入進度、預處理以及我們有一個可變基因選擇方法，這實際上是這個工作流程的支柱。
	因此，對於可變基因選擇，此方法的目標是減少基因的維度。
	因為對於人類樣本來說，我們有 30,000 個基因，但並非所有基因都有資訊。 因此，我們嘗試選擇資訊最豐富的內容。
	分散法和
	基於最低迴歸的變異穩定變換方法。 所以，我不會詳細介紹，但這兩種方法在研究界廣泛使用，我很高興我們能夠重現它們。
	我們也應用稀疏 SVD 來進一步降低維度。 因此我們也應用了層次聚類和 ak 均值聚類。
	我們在 JMP 中使用增強森林方法進行特徵重要性篩選，如果您安裝了 R 軟體包，我們將直接呼叫 T-SNE 和 UMAP 視覺化
	單細胞 RNA 定序分析非常流行。 我們也提供了一些動態視覺化，包括小提琴圖、山脊線圖、dop 圖；我們也進行差異基因表現。 因此，所有報告都將與 JMP 專案組織在一個非常整合的報告中。
	那麼接下來我會做一個demo。 該演示有兩個目標。 第一個是對該 PBMC 資料集中的細胞群進行分類。 我們嘗試找出該資料集中的細胞類型。 第二個目標是識別不同亞型和條件下差異表達的牛仔褲。
	首先，我們先來看看 JMP Genomics 入門版。 因此，JMP Genomics 介面看起來與常規 JMP 有很大不同，但是
	它很容易導航。 如果您想了解工作流程基礎知識
	基本的單細胞RNA定序工作流程就在這裡，你點選就可以調出這個介面。 所以介面非常直覺。 我會說你只提供一個資料集。
	您也可以指定 QC 選項。 您想要去除什麼、什麼類型的基因或細胞以進行分析和可變基因選擇。 你想用哪一種方法，對吧。 如果選擇VST，也可以指定要保留的基因數量，2000或3000
	以及聚類選項，對吧，您想要使用多少個主成分進行聚類，以及
	要么您需要分層演算法，要么需要 k 表示聚類演算法。 選擇越多，我們就有標記基因
	幫助您添加要用於識別細胞群的標記基因列表，這是非常方便的工具。 您還可以啟動方差分析和差異表達分析。 所以這是一份單獨的報告。
	我不會在這次演講中討論這個問題。 所以我們的另一件事是實驗範例，對吧。 如果您補充說，基本上您可以提供與開始設計相關的任何信息，例如治療信息，
	性資訊。 所以這是
	這裡的模擬數據。 我只是想向您展示我們如何比較基因表現量和組間的不同測量結果。
	最後，我們有嵌入選項，如果您安裝了 t-SNE 或 UMAP R 軟體包，可以呼叫它們。 您可以為此更改我們演算法的不同參數。
	因此，在指定所有這些選項後，只需運行即可，然後您將獲得如下所示的報告。 所以這是一個
	表格報告。 該報告共有七個選項卡。 我按照你想要的順序組織了它們
	有多少個基因
	細胞中的讀取計數或粒線體基因計數在數據中所佔的百分比是多少，以及這三個測量值之間的相關性。
	你注意到左邊，我們有操作框。 您可以展開它並在其中找到選項，在這個框中您可以用它做很多事情。
	具體來說，在此標籤中，您可以根據實驗設計文件中提供的條件分割圖表。 例如，我們可以進行一次治療，然後分開
	藥物 1、藥物 2、安慰劑。 然後你可以看看不同組之間有沒有什麼區別，對吧，如果你想回到我們原來的劇情我們可以不分裂。
	第二個選項卡是可變基因選擇，這是此工作流程的支柱。 紅點表示我選擇用於後續分析的基因，這些
	灰點是分析中將被丟棄的基因。 如果展開操作框，您可以看到，由於我們使用 VST，所以我們指定了 2000 個基因
	在這個分析中。 但如果你改變主意，你可以，你可以，每當你改變主意時，你可以輸入不同數量的基因，然後點擊「確定」。 因此，所有選項卡都將根據這個新數字進行刷新。
	所以當你有了可變基因清單後，你要做的就是透過進行稀疏SVD分析來進一步降低維度，這相當於主成分分析。
	因此，在應用 SVD 分析後，您可以繪製出前兩個 SVD 或主成分。 嘗試檢查資料集的全域結構。
	所以在這個例子中，我們可以看到這個資料集中有兩大組，這很有趣。 我們還提供了 3D 圖來幫助您進一步探索
	您的數據。 有時，有一些你無法、無法在二維圖中辨識的見解； 3D 繪圖有時確實可以提供額外的價值。
	我們有這些 SVD，根據您選擇的數量（20 或 30），您可以使用它們
	執行聚類。 在本例中，我們選擇了層次聚類，並在您的資料集中找到了 9 個聚類。
	除了樹狀圖之外，我們還提供星座圖
	我真的很喜歡，因為這個圖與 t-SNE 或 UMAP 相似。 它可以讓你更了解不同群體之間的距離，對吧。
	例如有三組，大組，三簇
	與其他群體有點不同。 如果您想查看它們在全域結構中的位置，這是我檢測到的前三個叢集。 看看 3D 圖，我們可以看到
	所有突出顯示的都在這裡。 然後再次進入 2D，這是兩個大集群之一，你知道，我說過我強調了這一點，所以它的互動性確實可以幫助你
	以多種方式觀察和視覺化您的數據。 我們還提供了一個平行圖來幫助您進一步識別不同群體之間的不同模式。
	下一個選項卡是嵌入，這表示如果您安裝了 R 包裝，則表示 t-SNE 和 UMAP 部分。 我會
	呼叫 R、運行分析、帶回資料並在 JMP 中進行視覺化。 這是一個 t-SNE 圖。 我們有九個簇，很好地分開。
	底部是完全相同的圖，但這次我用您提供的標記基因對它們進行了著色；我們有 14 個標記基因。 因此您可以使用此功能切換到點擊
	看看這些基因在哪裡表達，對吧。 例如，有一個 GNLY 基因，在這個小簇中高度表達，我們想知道，我們的數據是什麼？ 我們選擇並返回，現在我們看到了所有，其中大多數來自簇九、簇八。
	所以GNLY是NK細胞的一個基因。 這是 NK 細胞的標記基因。 現在我們知道這個細胞群是什麼了，對吧。
	我們這裡還有操作按鈕，可以幫助您做更多事情。 如果您想切換到 UMAP，如果您願意的話，您可以這樣做。 現在這些圖與 UMAP 相關聯。
	完全相同的事情，但 UMAP 確實為您提供了更好的分離，並且它可以在視覺化中保留更多的全局結構。 我們也可以提供一些方法來幫助您去除可能存在的細胞。
	被污染或有品質問題。 例如，我們不喜歡這裡的一組單元格，我們可以將它們從視覺化中刪除。 讓它變得更乾淨，但你隨時可以把它們帶回來。
	同樣，我們可以分割圖，這是一個分割圖按鈕。 這次，我們可以以性別來劃分，我們以女性、男性來劃分。 是的，我們可以比較不同性別群體的基因表現水平，有時非常有用。
	我們是分裂的。
	下一個選項卡為您提供更多視覺化工具，以可視化九個基因的基因表現水平
	組，九組細胞，右。 所以第一部分被稱為小提琴情節。 同樣，我們有一個功能切換器可以幫助您完成
	所有這些基因都在不同的簇中，對吧。 現在您可以根據高度來查看圖形部分的高度及其密度。
	您可以清楚地看到這些基因在哪裡高度表達。 例如，我們再次舉個例子，我正在使用這個基因，GNLY，你可以看到它在簇八中高度表達。
	在中間，我們為您提供的第二個圖是山脊線圖。 山脊線圖正在組織
	Y 軸為聚類，X 軸為基因表現量。 但它基本上是根據你的喜好為你提供類似的東西。
	例如，GNLY，我們再次可以看到簇八的 GNLY 被結或其他簇高度表達。
	底部我們有另一個圖，稱為點圖。 這是我們剛剛添加到本報告中的新圖。 除了顯示基因表現量之外，點圖還可以顯示表達該基因的細胞的百分比。 例如，看看這個地方，
	PPBP基因。 我們可以看到這個簇，在我們擁有的簇七中，我們可以看到簇七中 100% 的細胞表達這個 PPBP 基因。 所以這個基因就是標記基因
	實際上是PPBP細胞。 現在很清楚，第七簇是一種血細胞，即 PPBP 細胞，他們會檢查其他細胞，例如第二簇。
	只有 12% 的細胞表達該基因。 所以可能會有一些污染，但這組細胞絕對不是PPBP細胞。 所以這個劇情只是向你展示
	每個簇中的表達量和表達量百分比，在圖中提供了附加資訊。
	所以下一個選項卡也非常有用。 這稱為特徵篩選。 我所做的是衰落增強森林演算法，然後使用該基因來預測簇。 因此，有助於細胞分離的最重要基因在此表中排名。
	查看這些基因的正確方法是打開這個操作框。 您可以選擇想要視覺化的前 35 個基因。 按一下“確定”。
	因此，下一個選項卡將僅顯示您選擇的 35 個基因。 這些就是基因，其中大部分資訊是基因。 正確的。 他們，他們可以解釋
	為什麼這些不同的細胞群被分開。 再說一遍，我們只是切換，或者您可以點擊並嘗試查看模式。 然後如果你注意到的話，有很多基因 LYZ，
	CST3 和 NKG7。 這些已經在標記基因中或已提供，這意味著該特徵篩選
	方法確實成功地提取了資料集中那些最重要的基因。 另一件事，你可以透過 GTEx 資料庫進行視覺化。 GTEx 是一個組織特異性資料庫。
	告訴您哪些基因在人體的哪些組織中表現。 所以我們可以直接將基因清單傳送到資料庫。 您只需按一下“確定”即可。 我們將打開
	網站和 GTEx 網站將為您提供熱圖，對吧，所以有前 35 個基因。 現在你可以看到我在這兩個人體組織、器官中表達的位置，非常方便看到額外資訊。
	現在我們已經使用了這些標記基因，您可能可以識別它們是哪一組細胞，對吧。 所以有一個
	這裡的函數稱為重新編碼。 它的作用是，你打開它，現在你可以將這些數字重新編碼為實際的單元格名稱，對吧。 例如，八個我們已經知道它是NK，它是NK細胞。 我們可以做……我已經為他們每個人取了名字。 所以我只需輸入
	那些
	鈹石。
	兩個實際上是DC電池；三是FCGR3A+單石。
	這些是原始 CD+ T 細胞。
	第五組記憶 CD4+ T 細胞。
	和CD8+T
	關美健
關美健	對於第六組；正如我們已經看到的，第七個是 PPBP，第九個是 B 細胞。
	因此，透過這些重新編碼，我們點擊「重新編碼」。 現在，由於所有繪圖和選項卡都已連接，現在您可以發現所有數字都已變更為實際的儲存格名稱。 所以它只是幫助你探索你的數據
	很容易，對吧。 您可以知道這些單元格在哪裡，並且可以再次在繪圖上和繪圖中進行一些探索。 再說一次，包括這個聚類圖，您知道，看到自訂名稱已更改為實際的單元格名稱。 嗯，所以
	今天的主題就到此為止。 如果您有任何疑問，可以給我發送電子郵件或在 JMP 社群上留言。 非常感謝您的參與。

爆發數據探索數據視覺化