Vocero
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Transcripción
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| Meijian Guan |
Está bien. Hola a todos. Muchas gracias por asistir a esta presentación. Estoy muy feliz de tener esta oportunidad de compartir el trabajo que tengo. |
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Hemos estado haciendo con el grupo JMP Life Science y el SAS Institute. Entonces, el tema de hoy será la construcción de un flujo de trabajo de secuenciación de ARN unicelular con el Proyecto JMP. Esta es una nueva característica que desarrollé para JMP Genomics 10. Si no sabes qué es JMP Genomics, te daré una breve |
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Una descripción general al respecto y el proyecto JMP es una característica nueva, lanzada el 14 y es una herramienta muy buena que puede ayudarlo a organizar sus informes. Así que aprovechamos esta nueva plataforma y organizamos un estudio de secuenciación de ARN unicelular. |
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flujo de trabajo en él. Primero que nada, solo quiero brindarles un poco de información sobre JMP. JMP Genomics es |
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Uno de los productos de la familia JMP está construido sobre SAS y JMP Pro. Por lo tanto, aprovechar ambos productos lo convierte en una herramienta analítica muy poderosa. |
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Por lo tanto, está diseñado para datos genómicos, por lo que puede leer diferentes tipos de datos genómicos, puede realizar un preprocesamiento y puede manejar la secuenciación de ese análisis de próxima generación. |
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Es realmente bueno en la expresión genética diferencial y el descubrimiento de biomarcadores, y muchos científicos lo utilizan para la cría de cultivos y ganado. Entonces es una herramienta muy poderosa. Animo a todos a que lo consulten si están haciendo algo relacionado con la genómica. |
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Y lo siguiente que quiero compartir con ustedes es la secuenciación del ARN unicelular. Puede que muchos de vosotros no estéis muy familiarizados con él. |
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Esta es una tecnología relativamente nueva que se utiliza para examinar eso a nivel de células individuales. |
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Y en comparación con la tecnología tradicional de secuenciación de ARN que es encuesta, el nivel de expresión promedio de un grupo de células. |
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Esta nueva tecnología proporciona una mayor resolución de las diferencias celulares y brinda una mejor comprensión de la función de la célula individual en el contexto de su microentorno. |
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Y puede ayudar a hacer muchas cosas, como descubrir poblaciones de células nuevas y raras, rastrear trayectorias de desarrollo celular e identificar genes expresados diferencialmente entre tipos de células. Por eso tiene una aplicación muy amplia. |
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Una aplicación reciente es que los científicos la usan para combatir Covid 19, por lo que se puede usar para |
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caracterizar los cambios transcripcionales en las células inmunes y cómo desarrollar las vacunas y el tratamiento. Además de eso, se usa ampliamente en la investigación del cáncer y en inmunología y en muchos otros campos de investigación. Um, entonces es una herramienta muy poderosa, pero |
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Tiene algunos desafíos para analizar esos datos, por eso elaboramos este flujo de trabajo. |
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Solo quería brindarles una descripción general de la línea superior de la secuenciación de ARN unicelular. Entonces, lo primero que necesitas es obtener una muestra, |
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ya sea de humanos o de animales. Podría ser un tumor o una muestra de laboratorio. Y luego puedes aislar esas muestras en células individuales. |
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Entonces, después de aislar, puede secuenciar en cada célula individual todos los genes que tiene. Por ejemplo, en los humanos tenemos alrededor de 30.000 genes. Entonces el producto final se verá así en nuestra tabla de recuento de lecturas. Tenemos genes... 30.000 genes en filas y tenemos |
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a veces alrededor de medio millón de celdas como columnas. Como puede ver, cumplir con estos conjuntos de datos tan grandes tiene dimensiones muy altas. También puedes notar los ceros en la tabla porque |
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Debido a limitaciones técnicas o biológicas, no hay manera de que podamos detectar cada gen en cada célula. Así que no es raro ver que el 90% de las células en realidad son |
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ceros. Entonces es muy escaso. La escasez es otro desafío cuando se analizan datos de secuenciación de ARN unicelular. |
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Pero después de realizar el preprocesamiento, la limpieza y la reducción de dimensiones, puede aplicar análisis de expresión genética diferencial regulares, como agrupación y componentes principales, en estos datos. Entonces esos se mencionarán en mi flujo de trabajo. |
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Y ya mencioné esto que noté desafíos, incluida la alta dimensionalidad, la alta escasez y también una heterogeneidad variable entre las poblaciones celulares. |
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Ruidos técnicos y reproducibilidad, dado que hay tantos protocolos de secuenciación diferentes, tantos paquetes analíticos diferentes. |
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En R, Python u otras herramientas, le resulta muy difícil seguir los pasos exactos para analizar sus datos. Y si confundiste los pasos y no hiciste las cosas en el orden correcto, |
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es posible que no pueda obtener resultados reproducibles. Ese es uno de los problemas que intentamos resolver aquí. |
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Sólo quiero mostrarles un ejemplo de datos de secuenciación de ARN unicelular. Estos datos se utilizarán en mi demostración y son datos de muestra de sangre reducidos o ppm. Mira, dije que tenemos células en filas y genes en columnas, así que es |
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alrededor de 8000 columnas y 100 |
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filas, lo que significaría celdas. Y puedes ver esos ceros, prácticamente en todas partes. Creo que hay más del 90% de escasez en este conjunto de datos específico. |
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Entonces, ¿qué hay en nuestro nuevo flujo de trabajo de secuenciación de ARN unicelular en JMP Genomics 10? Entonces, para este flujo de trabajo, intentamos construirlo. |
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para aquellas personas que no tienen muy buena formación técnica o no, no tienen tiempo para aprender a codificar y todas esas estadísticas. Entonces, en este flujo de trabajo colocamos esos pasos en el orden correcto para que los usuarios ejecuten automáticamente los demás pasos del flujo de trabajo. y nosotros también |
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Proporciona informes muy interactivos para ayudar a los usuarios a navegar con nosotros, cambiar los parámetros y comprobar diferentes selecciones. |
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Entonces, ¿qué hay en este flujo de trabajo, incluido el progreso de la importación de datos, el preprocesamiento y tenemos un método de selección de genes variable, que en realidad es la columna vertebral de este flujo de trabajo? |
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Por lo tanto, para la selección de genes variables, el objetivo de este método es reducir una dimensión de los genes. |
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Porque para la muestra humana tenemos 30.000 genes y no todos son informativos. Por eso intentamos elegir los más informativos. |
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método de dispersión y |
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Método de transformación estabilizadora de la variabilidad basado en la regresión más baja. Por lo tanto, no entraré en detalles, pero estos dos métodos se utilizan ampliamente en la comunidad de investigación y estoy muy feliz de que hayamos podido reproducirlos. |
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Y también aplicamos SVD escaso para reducir aún más las dimensiones. Y entonces también aplicamos agrupación jerárquica y ak significa agrupación. |
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Tenemos una detección de importancia de características utilizando un método de bosque de impulso en JMP y si tiene paquetes R instalados, llamamos directamente a la visualización T-SNE y UMAP. |
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que es muy popular mediante un análisis de secuenciación de ARN unicelular. Y también proporcionamos algunas visualizaciones dinámicas que incluyen diagrama de violín, diagrama de cresta, diagrama de dop; También hacemos expresión genética diferencial. Y así, todos los informes se organizarán en informes muy integrados con el proyecto JMP. |
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A continuación haré una demostración. Hay dos objetivos en esta demostración. El primero es clasificar las poblaciones de células en este conjunto de datos de PBMC. Intentamos encontrar cuáles son los tipos de células en este conjunto de datos. El segundo objetivo es simplemente identificar los jeans con expresiones diferenciales entre subtipos y condiciones. |
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Primero que nada, vayamos al iniciador de JMP Genomics. Entonces, la interfaz de JMP Genomics se ve bastante diferente de la de JMP normal, pero |
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es bastante fácil de navegar. Si desea encontrar los conceptos básicos de los flujos de trabajo |
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y el flujo de trabajo básico de secuenciación de ARN unicelular se encuentra aquí, haga clic para abrir esta interfaz. Entonces la interfaz es bastante intuitiva. Diré que simplemente proporcionas un conjunto de datos. |
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Y usted especifica las opciones de control de calidad. Qué, qué tipos de genes o células desea eliminar para su análisis y selección de genes variables. ¿Cuál método quieres usar? Si selecciona un VST, también puede especificar la cantidad de genes que desea conservar, 2000 o 3000 |
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Y las opciones de agrupación, cierto, ¿cuántos componentes principales desea utilizar para la agrupación y |
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O quieres algoritmos jerárquicos o k significa agrupamiento. Y cuantas más opciones, tenemos genes marcadores. |
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para ayudarle a agregar una lista de genes marcadores que desea utilizar para identificar las poblaciones de células, lo cual es una herramienta muy útil en este caso. Y puede iniciar ANOVA y análisis de expresión diferencial. Entonces este es un informe separado. |
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No discutiré esto en esta charla. Otra cosa que tuvimos fue un ejemplo de experimento, ¿verdad? Si agrega eso, básicamente puede proporcionar cualquier información relacionada con el diseño inicial, como información del tratamiento, |
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información sexual. Entonces esto es |
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Los datos simulados aquí. Solo me gustaría mostrarles cómo compararemos los niveles de expresión genética y las diferentes mediciones entre grupos. |
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Y finalmente, tenemos opciones de incrustación que pueden llamar a paquetes t-SNE o UMAP R si los tiene instalados. Puede cambiar diferentes parámetros para esto en nuestros algoritmos. |
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Entonces, después de especificar todas esas opciones, simplemente vaya a ejecutar y luego tendrá el informe que se parece a este. Entonces este es un |
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informe tabular. Hay un total de siete pestañas en este informe. Los organicé en el orden que quieras. |
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cuantos genes hay |
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en las células, cuántos recuentos de lecturas o cuál es el porcentaje de recuentos de genes de mitocondrias en sus datos y las correlaciones entre estas tres mediciones. |
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Y nosotros, como ven en este lado izquierdo, tenemos el cuadro de acción. Puedes expandirlo y encontrar opciones en este, en este cuadro puedes hacer muchas cosas con él. |
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En esta pestaña, específicamente, puede dividir el gráfico, según las condiciones que proporcionó en el archivo de diseño experimental. Por ejemplo, podemos hacer un tratamiento y dividimos |
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Fármaco1, Fármaco2, placebo. Luego podrás ver si hay alguna diferencia entre los diferentes grupos, cierto, y podemos separarnos si quieres volver a nuestra trama original. |
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Y la segunda pestaña es la selección de genes variables, que es la columna vertebral de este flujo de trabajo. Los puntos rojos significan aquellos genes que seleccioné para análisis posteriores y estos |
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Los puntos grises son los genes que se descartarán en el análisis. Y si expande el cuadro de acción, puede ver que, dado que usamos VST, especificamos 2000 genes. |
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en este análisis. Pero si cambia de opinión, puede, puede, siempre que cambie de opinión, puede escribir una cantidad diferente de genes y luego hacer clic en Aceptar. Entonces, todas las pestañas se actualizarán según este nuevo número. |
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Entonces, una vez que tenga una lista de genes variables, lo que va a hacer es reducir aún más las dimensiones realizando un análisis SVD disperso, que es equivalente al análisis de componentes principales. |
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Entonces, después de aplicar el análisis SVD, puede trazar los dos SVD principales o componentes principales. Intente comprobar la estructura global de su conjunto de datos. |
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Entonces, en este caso, podemos ver que hay dos grandes grupos en este conjunto de datos, lo cual es interesante. Y también proporcionamos una trama en 3D para ayudarlo a explorar más a fondo. |
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tu información. A veces hay algunas ideas que no puedes identificar en una trama 2D; Los gráficos en 3D a veces pueden aportar un valor adicional. |
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Y tenemos esos SVD, dependiendo de cuántos hayas seleccionado (20 o 30), puedes usarlos para |
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realizar agrupaciones. En este caso seleccionamos agrupación jerárquica y encontramos nueve agrupaciones en su conjunto de datos. |
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Además del dendograma, también ofrecemos un gráfico de constelaciones. |
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lo cual me gusta mucho porque esta trama es similar a t-SNE o UMAP. Te da una mejor idea sobre la distancia entre los diferentes grupos, ¿verdad? |
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Por ejemplo, hay tres grupos, grandes grupos, tres clusters. |
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Algo distinto de otros grupos. Y si quieres ver dónde están en la estructura global aquí, estos son los tres grupos principales que detecto. Mire los gráficos 3D, podemos ver. |
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Todos los resaltados están por aquí. Y luego vayamos a 2D nuevamente, este es uno de los dos grandes grupos, ya sabes, que dije que resalté, así que su interactividad realmente te ayuda a |
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observe y visualice sus datos de múltiples maneras. Y también proporcionamos un gráfico paralelo para ayudarlo a identificar mejor los diferentes patrones en los diferentes grupos. |
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Y la siguiente pestaña es incrustar, lo que significa piezas t-SNE y UMAP si tiene el paquete R instalado. lo haré |
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Llame a R, ejecute el análisis, recupere los datos y visualícelos en JMP. Así que aquí hay un gráfico t-SNE. Tenemos nueve grupos muy bien separados. |
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En la parte inferior hay exactamente el mismo gráfico, pero esta vez los coloreé con los genes marcadores que me proporcionaste; tenemos 14 genes marcadores. Así que puedes, usando esta función, cambiar para hacer clic |
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para ver dónde se expresan estos genes, ¿verdad? Por ejemplo, hay un gen GNLY altamente expresado en este pequeño grupo y nos preguntamos: ¿cuáles son nuestros datos? Seleccionamos y volvemos y ahora vemos todos, la mayoría son del grupo nueve, grupo ocho. |
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Entonces GNLY es un gen para las células NK. Este es un gen marcador de células NK. Ahora tenemos una idea de qué es un grupo de esta célula, ¿verdad? |
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Y también tenemos botones de acción aquí, que te ayudarán a hacer más cosas. Si quieres cambiar a UMAP, si lo prefieres, puedes hacerlo. Ahora las parcelas se asocian a la UMAP. |
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Exactamente lo mismo, pero UMAP le brinda una separación un poco mejor y puede preservar una estructura más global en la visualización. Y también podemos brindarle algunas formas de ayudarlo a eliminar las células que podrían estar |
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contaminados o tienen algunos problemas de calidad. Por ejemplo, aquí no nos gusta un grupo de celdas, podemos eliminarlas de la visualización. Hazlo más limpio, pero siempre podrás recuperarlos. |
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Y nuevamente, podemos dividir las gráficas, que es un botón para dividir gráficos. Esta vez, podemos dividir por género, dividimos por mujer, hombre. Bien, podemos comparar el nivel de expresión genética entre los grupos de género, lo cual a veces es bastante útil. |
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Y estamos divididos. |
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Y la siguiente pestaña le proporciona más herramientas de visualización para visualizar los niveles de expresión genética en los nueve |
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grupos, nueve celdas de grupo, derecha. Por eso la primera parte se llama trama de violín. Nuevamente, tenemos un selector de funciones que lo ayudará a recorrer |
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Todos esos genes en diferentes grupos, ¿verdad? Ahora puedes ver, según cómo, qué altura tiene la parte del gráfico y cuál es su densidad. |
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Se puede ver claramente dónde se expresan altamente esos genes. Por ejemplo, nuevamente, damos un ejemplo: estoy usando este gen, GNLY, pueden ver que está altamente expresado en el grupo ocho. |
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Y en el medio, la segunda parcela que les proporcionamos es la parcela de cresta. Una parcela de cresta está organizando el |
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grupos en el eje Y y el nivel de expresión génica en el eje X. Pero básicamente te proporciona algo similar dependiendo de lo que te guste. |
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Por ejemplo, GNLY, nuevamente, podemos ver que el grupo ocho tiene GNLY altamente expresado por nudos u otros grupos. |
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Y en la parte inferior tenemos otro gráfico llamado diagrama de puntos. Esta es la nueva trama que acabamos de agregar a este informe. Además de mostrarle los niveles de expresión genética, el diagrama de puntos también puede mostrarle el porcentaje de células que expresan ese gen. Por ejemplo, eche un vistazo a este lugar, |
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Gen PPBP. Y podemos ver este grupo, en el grupo siete que hemos tenido, podemos ver el 100% de las células en el grupo siete que expresan este gen PPBP. Entonces este gen es el gen marcador para |
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En realidad, células PPBP. Ahora está muy claro que el grupo siete es un tipo de célula sanguínea, que es una célula PPBP, y analizan otras, como por ejemplo, el grupo dos. |
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Sólo el 12% de las células expresan este gen. Entonces puede haber cierta contaminación, pero este grupo de células definitivamente no son células PPBP. Entonces esta trama solo te muestra |
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el nivel de expresión y el porcentaje de expresión en cada grupo que ofrece información adicional en el gráfico. |
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Entonces la siguiente pestaña también es muy útil. Se llama selección de características. Lo que hice fue un algoritmo de bosque que se desvanecía y luego usé esos genes para predecir los grupos. En esta tabla se clasifican los genes más importantes que contribuyeron a la separación de las células. |
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Y la forma correcta de ver estos genes es abrir este cuadro de acción. Usted selecciona este top, tal vez los 35 genes principales que desea visualizar. Haces clic en Aceptar. |
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Entonces, la siguiente pestaña le mostrará solo 35 genes que seleccionó. Entonces esos son los genes, en su mayoría informativos. Bien. Ellos, ellos pueden explicar |
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por qué esos diferentes grupos de células están separados. Nuevamente, simplemente cambiamos o puedes hacer clic e intentar ver los patrones. Y luego, si te fijas, hay muchos genes LYZ, |
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CST3 y NKG7. Estos ya están en los genes marcadores o fueron proporcionados, lo que significa que esta característica se detecta |
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El método es realmente exitoso para detectar los genes más importantes en su conjunto de datos. Y otra cosa que puedes hacer es la visualización a través de la base de datos GTEx. GTEx es una base de datos específica de tejidos. |
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Le dirá qué genes se expresan en qué tejido de su cuerpo humano. Entonces podemos enviar directamente la lista de genes a la base de datos. Simplemente haga clic en Aceptar. abriremos el |
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El sitio web y el sitio web de GTEx le proporcionarán un mapa de calor, cierto, con los 35 genes principales. Ahora pueden ver dónde me he expresado en esos dos tejidos y órganos humanos, lo cual es muy conveniente para ver información adicional. |
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Entonces, ahora que utilizamos esos genes marcadores, probablemente puedas identificar qué grupo de células son, ¿verdad? Entonces hay uno |
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La función aquí se llama recodificación. Lo que hace es que lo abres y ahora puedes recodificar esos números en nombres de celda reales, ¿verdad? Por ejemplo, ocho ya sabemos que son NK, son células NK. Y podemos hacerlo... Ya tengo nombres para cada uno de ellos. Así que simplemente escribo |
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Aquellos |
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Monocita. |
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En realidad, dos son células de CC; tres es monocita FCGR3A+. |
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Estas son células T CD+ ingenuas. |
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Grupo cinco células T CD4+ de memoria. |
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y CD8+T |
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Meijian Guan |
| Meijian Guan |
para el grupo seis; siete es PPBP, como ya vimos y el noveno son células B. |
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Entonces con esos recodificar hacemos clic en recodificar. Ahora que todos los gráficos y las pestañas están conectados, ahora puede encontrar que todos los números han cambiado a nombres de celda reales. Así que solo te ayudará a explorar tus datos en |
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fácilmente, cierto. Puede saber dónde están esas celdas y nuevamente puede explorar un poco sus tramas. Y nuevamente, incluyendo estos gráficos de agrupación, ya sabes, verás que el nombre personalizado se ha cambiado a los nombres de celda reales. Eh, entonces |
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Eso es todo por el tema de hoy. Y si tienes alguna duda, puedes enviarme un correo electrónico o dejar un mensaje en la Comunidad JMP. Muchísimas gracias por su tiempo. |
