Lautsprecher
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Transkript
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| Meijian Guan |
In Ordnung. Ähm, hallo alle zusammen. Vielen Dank für Ihre Teilnahme an dieser Präsentation. Ich bin so glücklich, dass ich die Gelegenheit habe, meine Arbeit zu teilen |
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haben mit der JMP Life Science Group und dem SAS Institute zusammengearbeitet. Das heutige Thema wird also der Aufbau eines Einzelzell-RNA-Sequenzierungs-Workflows mit JMP Project sein. Das ist also eine neue Funktion, die ich für JMP Genomics 10 entwickelt habe. Wenn Sie nicht wissen, was JMP Genomics ist, gebe ich Ihnen eine kurze Beschreibung |
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Überblick darüber und das JMP-Projekt ist eine neue Funktion, die am 14. veröffentlicht wurde und ein sehr schönes Tool ist, das Ihnen bei der Organisation Ihrer Berichte helfen kann. Also nutzten wir diese neue Plattform und organisierten eine Einzelzell-RNA-Sequenzierung |
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Workflow hinein. Daher möchte ich Ihnen zunächst ein wenig Hintergrundinformationen zu JMP geben, das heißt JMP Genomics |
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Eines der Produkte der JMP-Familie basiert auf SAS und JMP Pro. Durch die Nutzung beider Produkte entsteht ein sehr leistungsfähiges Analysetool. |
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Es ist also für Genomdaten konzipiert, kann also verschiedene Arten von Genomdaten einlesen, kann Vorverarbeitungen durchführen und Next-Generation-Sequencing-Analysen durchführen. |
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Es eignet sich wirklich gut für die differenzielle Genexpression und die Entdeckung von Biomarkern und wird von vielen Wissenschaftlern für die Pflanzen- und Viehzucht eingesetzt. Es ist also ein sehr mächtiges Werkzeug. Ich ermutige jeden, es sich anzusehen, wenn Sie etwas mit Genomik zu tun haben. |
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Und als nächstes möchte ich Ihnen die Einzelzell-RNA-Sequenzierung vorstellen. Viele von Ihnen sind damit möglicherweise nicht sehr vertraut. |
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Es handelt sich also um eine relativ neue Technologie, mit der das auf der Ebene einzelner Zellen untersucht wird. |
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Und im Vergleich zur herkömmlichen RNA-Sequenzierungstechnologie wird das durchschnittliche Expressionsniveau einer Gruppe von Zellen untersucht. |
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Diese neue Technologie ermöglicht eine höhere Auflösung zellulärer Unterschiede und ermöglicht ein besseres Verständnis der Funktion der einzelnen Zelle im Kontext ihrer Mikroumgebung. |
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Und es kann dabei helfen, viele Dinge zu tun, wie zum Beispiel neue und seltene Zellpopulationen aufzudecken, den Verlauf der Zellentwicklung zu verfolgen und unterschiedlich exprimierte Gene zwischen Zelltypen zu identifizieren. Es hat also eine sehr breite Anwendung. |
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Eine aktuelle Anwendung besteht darin, dass Wissenschaftler es zur Bekämpfung von Covid 19 einsetzen, damit es verwendet werden kann |
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Charakterisierung von Transkriptionsveränderungen in Immunzellen und Entwicklung von Impfstoffen und Behandlungsmöglichkeiten. Darüber hinaus wird es häufig in der Krebsforschung und in der Immunologie und in vielen anderen Forschungsbereichen eingesetzt. Ähm, es ist also ein sehr mächtiges Werkzeug, aber |
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Die Analyse dieser Daten ist mit einigen Herausforderungen verbunden. Aus diesem Grund haben wir diesen Workflow zusammengestellt. |
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Ich wollte Ihnen nur einen Überblick über die oberste Zeile der Einzelzell-RNA-Sequenzierung geben. Als erstes müssen Sie also eine Probe besorgen, |
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entweder vom Menschen oder vom Tier. Es könnte sich um einen Tumor oder eine Laborprobe handeln. Und dann können Sie diese Proben in einzelne Zellen isolieren. |
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Nach der Isolierung können Sie also jede einzelne Zelle für alle Gene, die Sie haben, sequenzieren. Beim Menschen zum Beispiel haben wir etwa 30.000 Gene. Das Endprodukt wird in unserer Leseanzahltabelle also so aussehen. Wir haben Gene ... 30.000 Gene in Reihen und wir haben |
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etwa eine halbe Million Zellen als Spalten. Wie Sie sehen, hat die Erfüllung dieser sehr großen Datensätze sehr große Dimensionen. Sie können auch die Nullen in der Tabelle erkennen, weil |
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Aufgrund technischer oder biologischer Einschränkungen ist es uns nicht möglich, jedes einzelne Gen in jeder einzelnen Zelle zu erkennen. Daher ist es nicht ungewöhnlich, dass dies bei 90 % der Zellen tatsächlich der Fall ist |
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Nullen. Es ist also sehr spärlich. Sparsity ist eine weitere Herausforderung, wenn Sie Einzelzell-RNA-Sequenzierungsdaten analysieren. |
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Aber nachdem Sie die Vorverarbeitung, Bereinigung und Dimensionsreduzierung durchgeführt haben, können Sie auf diese Daten regelmäßige differenzielle Genexpressionsanalysen wie Clustering und Hauptkomponenten anwenden. Diese werden also in meinem Workflow erwähnt. |
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Und ich habe bereits darauf hingewiesen, dass mir Herausforderungen aufgefallen sind, darunter hohe Dimensionalität, hohe Sparsität und auch unterschiedliche Heterogenität zwischen Zellpopulationen. |
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Technische Störungen und Reproduzierbarkeit, da es so viele verschiedene Sequenzierungsprotokolle und so viele verschiedene Analysepakete gibt. |
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In R, Python oder anderen Tools ist es für Sie sehr schwierig, die genauen Schritte zur Analyse Ihrer Daten zu befolgen. Und wenn Sie die Schritte verwechselt und die Dinge nicht in der richtigen Reihenfolge ausgeführt haben, |
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Möglicherweise erhalten Sie keine reproduzierbaren Ergebnisse. Das ist also eines der Probleme, die wir hier zu lösen versucht haben. |
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Ich möchte Ihnen nur ein Beispiel für Einzelzell-RNA-Sequenzierungsdaten zeigen. Diese Daten werden in meiner Demonstration verwendet und es handelt sich um reduzierte Blutprobendaten oder ppm. Sehen Sie, ich habe gesagt, wir haben Zellen in Zeilen und Gene in Spalten, also ist es so |
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etwa 8000 Spalten und 100 |
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Zeilen, was Zellen bedeuten würde. Und diese Nullen sieht man praktisch überall. Ich glaube, dass in diesem speziellen Datensatz mehr als 90 % der Sparsity vorliegen. |
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Was beinhaltet also unser neuer Arbeitsablauf zur Einzelzell-RNA-Sequenzierung in JMP Genomics 10? Also haben wir versucht, diesen Workflow zu erstellen |
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Für diejenigen, die keinen sehr guten technischen Hintergrund haben oder keine Zeit haben, das Programmieren und all diese Statistiken zu lernen. In diesem Workflow bringen wir diese Schritte in die richtige Reihenfolge, damit Benutzer die anderen Schritte im Workflow automatisch ausführen können. Und wir auch |
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Stellen Sie sehr interaktive Berichte bereit, um Benutzern die Navigation mit uns zu erleichtern, die Parameter zu ändern und verschiedene Auswahlmöglichkeiten auszuprobieren. |
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Was beinhaltet dieser Workflow, einschließlich Datenimportfortschritt, Vorverarbeitung und wir haben eine Methode zur variablen Genauswahl, die eigentlich das Rückgrat dieses Workflows ist? |
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Bei der variablen Genselektion besteht das Ziel dieser Methode also darin, die Dimension der Gene zu reduzieren. |
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Denn für den Menschen haben wir 30.000 Gene und nicht alle davon sind aussagekräftig. Deshalb versuchen wir, die informativsten auszuwählen. |
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Dispersionsmethode und |
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Variabilitätsstabilisierende Transformationsmethode basierend auf der niedrigsten Regression. Ich werde also nicht auf die Details eingehen, aber diese beiden Methoden werden in der Forschungsgemeinschaft häufig verwendet und ich bin ziemlich froh, dass wir sie reproduzieren konnten. |
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Und wir wenden auch spärliches SVD an, um die Abmessungen weiter zu reduzieren. Deshalb haben wir auch hierarchisches Clustering angewendet und ak bedeutet Clustering. |
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Wir führen eine Überprüfung der Funktionswichtigkeit mithilfe einer Boosting-Forest-Methode in JMP durch und wenn Sie R-Pakete installiert haben, werden wir direkt zur T-SNE- und UMAP-Visualisierung gerufen |
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Dies ist unter Verwendung einer Einzelzell-RNA-Sequenzierungsanalyse sehr beliebt. Und wir haben auch einige dynamische Visualisierungen bereitgestellt, darunter Violinplot, Ridgeline-Plot, Dop-Plot; Wir führen auch eine differenzielle Genexpression durch. Daher werden alle Berichte in einem sehr integrierten Berichtsprojekt mit JMP organisiert. |
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Als nächstes werde ich eine Demo machen. In dieser Demo gibt es zwei Ziele. Die erste besteht darin, die Zellpopulationen in diesem PBMC-Datensatz zu klassifizieren. Wir versuchen herauszufinden, welche Zelltypen in diesem Datensatz enthalten sind. Das zweite Ziel besteht einfach darin, unterschiedlich ausgeprägte Jeans über Subtypen und Bedingungen hinweg zu identifizieren. |
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Kommen wir also zunächst zum JMP Genomics-Starter. Die JMP Genomics-Schnittstelle sieht also ganz anders aus als normales JMP |
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Es ist ziemlich einfach zu navigieren. Wenn Sie die Grundlagen der Arbeitsabläufe finden möchten |
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und der grundlegende Arbeitsablauf für die Einzelzell-RNA-Sequenzierung ist hier vorhanden. Klicken Sie darauf, um diese Schnittstelle aufzurufen. Die Benutzeroberfläche ist also ziemlich intuitiv. Ich würde sagen, Sie stellen lediglich einen Datensatz bereit. |
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Und Sie legen die QC-Optionen fest. Was, welche Arten von Genen oder Zellen möchten Sie für Ihre Analyse und variable Genauswahl entfernen? Welche Methode Sie verwenden möchten, richtig. Wenn Sie ein VST auswählen, können Sie auch die Anzahl der Gene angeben, die Sie behalten möchten, 2000 oder 3000 |
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Und die Clustering-Optionen, richtig, wie viele Hauptkomponenten Sie für das Clustering verwenden möchten und |
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Entweder möchten Sie hierarchische oder k bedeutet Clustering-Algorithmen. Und je mehr Möglichkeiten wir haben, desto mehr Markergene haben wir |
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um Ihnen beim Hinzufügen einer Liste von Markergenen zu helfen, die Sie zur Identifizierung der Zellpopulationen verwenden möchten, was hier ein sehr praktisches Werkzeug ist. Und Sie können ANOVA und Differentialausdrucksanalysen starten. Das ist also ein separater Bericht. |
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Ich werde in diesem Vortrag nicht darauf eingehen. Eine andere Sache, die wir hatten, war ein Experimentbeispiel, richtig. Wenn Sie hinzufügen, dass Sie grundsätzlich alle Informationen im Zusammenhang mit dem Startdesign bereitstellen können, z. B. Behandlungsinformationen, |
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Sex-Informationen. Das ist also so |
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Die simulierten Daten finden Sie hier. Ich möchte Ihnen nur zeigen, wie wir die Genexpressionsniveaus und verschiedene Messungen zwischen Gruppen vergleichen. |
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Und schließlich haben wir Einbettungsoptionen, die t-SNE- oder UMAP-R-Pakete aufrufen können, wenn Sie diese installiert haben. Sie können hierfür verschiedene Parameter an unseren Algorithmen ändern. |
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Nachdem Sie also alle diese Optionen angegeben haben, gehen Sie einfach auf „Ausführen“ und schon erhalten Sie den Bericht, der wie dieser aussieht. Das ist also ein |
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tabellarischer Bericht. Dieser Bericht enthält insgesamt sieben Registerkarten. Ich habe sie in der von Ihnen gewünschten Reihenfolge angeordnet |
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wie viele Gene in |
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in den Zellen, wie viele Read Counts oder wie hoch ist der Prozentsatz der Mitochondrien-Gen-Counts in Ihren Daten und die Korrelationen zwischen diesen drei Messungen. |
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Und wir, Sie sehen diese linke Seite, wir haben die Aktionsbox. Sie können es erweitern und darin Optionen finden. In diesem Feld können Sie viele Dinge damit machen. |
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Auf dieser Registerkarte können Sie insbesondere das Diagramm aufteilen, basierend auf den Bedingungen, die Sie in der experimentellen Designdatei angegeben haben. Zum Beispiel können wir eine Behandlung durchführen und uns trennen |
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Medikament1, Medikament2, Placebo. Dann können Sie sehen, ob es Unterschiede zwischen verschiedenen Gruppen gibt, und wir können die Aufteilung aufheben, wenn Sie zu unserem ursprünglichen Plot zurückkehren möchten. |
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Und die zweite Registerkarte ist die variable Genauswahl, die das Rückgrat dieses Arbeitsablaufs bildet. Die roten Punkte bedeuten die Gene, die ich für die nachfolgende Analyse ausgewählt habe und diese |
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Graue Punkte sind die Gene, die bei der Analyse verworfen werden. Und wenn Sie das Aktionsfeld erweitern, sehen Sie, dass wir 2000 Gene angegeben haben, da wir VST verwenden |
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in dieser Analyse. Aber wenn Sie Ihre Meinung ändern, können Sie, wann immer Sie Ihre Meinung ändern, eine andere Anzahl von Genen eingeben und dann auf OK klicken. Daher werden alle Registerkarten basierend auf dieser neuen Nummer aktualisiert. |
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Nachdem Sie also eine Liste variabler Gene haben, werden Sie die Dimensionen weiter reduzieren, indem Sie eine Sparse-SVD-Analyse durchführen, die der Hauptkomponentenanalyse entspricht. |
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Nachdem Sie die SVD-Analyse angewendet haben, können Sie die beiden wichtigsten SVDs oder Hauptkomponenten grafisch darstellen. Versuchen Sie, die globale Struktur Ihres Datensatzes zu überprüfen. |
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In diesem Fall sehen wir also, dass es in diesem Datensatz zwei große Gruppen gibt, was interessant ist. Außerdem stellen wir Ihnen einen 3D-Plot zur Verfügung, der Ihnen bei der weiteren Erkundung hilft |
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deine Daten. Manchmal gibt es Erkenntnisse, die man in einem 2D-Diagramm nicht identifizieren kann; 3D-Plots können manchmal wirklich einen Mehrwert bieten. |
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Und wir haben diese SVDs, je nachdem, wie viele Sie ausgewählt haben (20 oder 30), können Sie sie verwenden |
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Clustering durchführen. In diesem Fall haben wir hierarchisches Clustering ausgewählt und in Ihrem Datensatz neun Cluster gefunden. |
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Zusätzlich zum Dendogramm bieten wir auch eine Sternbilddarstellung an |
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Was mir wirklich gefällt, weil dieser Plot t-SNE oder UMAP ähnelt. Es gibt Ihnen eine bessere Vorstellung vom Abstand zwischen verschiedenen Gruppen, richtig. |
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Es gibt zum Beispiel drei Gruppen, große Gruppen, drei Cluster |
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Irgendwie anders als andere Gruppen. Und wenn Sie hier sehen möchten, wo sie sich in der globalen Struktur befinden, sind dies die drei wichtigsten Cluster, die ich entdeckt habe. Schauen Sie sich die 3D-Plots an, wir können es sehen |
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Alle hervorgehobenen sind hier. Und dann gehen wir noch einmal zu 2D, das ist einer von zwei großen Clustern, die ich hervorgehoben habe, damit Ihnen die Interaktivität wirklich hilft |
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Beobachten und visualisieren Sie Ihre Daten auf verschiedene Arten. Und wir stellen auch ein Paralleldiagramm zur Verfügung, das Ihnen dabei hilft, die unterschiedlichen Muster in verschiedenen Gruppen besser zu identifizieren. |
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Und die nächste Registerkarte ist Einbettung, was t-SNE- und UMAP-Teile bedeutet, wenn Sie R-Pakete installiert haben. Ich werde |
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Rufen Sie R auf, führen Sie die Analyse durch, bringen Sie die Daten zurück und visualisieren Sie sie in JMP. Hier ist also ein t-SNE-Diagramm. Wir haben neun Cluster, die sehr schön voneinander getrennt sind. |
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Unten ist genau das gleiche Diagramm, aber dieses Mal habe ich sie mit den von Ihnen bereitgestellten Markergenen eingefärbt; Wir haben 14 Markergene. Mit dieser Funktion können Sie also zum Durchklicken wechseln |
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um zu sehen, wo diese Gene exprimiert werden, richtig. Es gibt zum Beispiel ein GNLY-Gen, das in diesem kleinen Cluster stark exprimiert wird, und wir fragen uns: Was sind unsere Daten? Wir wählen aus und gehen zurück und jetzt sehen wir alle, die meisten stammen aus Cluster neun und Cluster acht. |
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GNLY ist also ein Gen für NK-Zellen. Dies ist ein Markergen für NK-Zellen. Jetzt haben wir also eine Vorstellung davon, was eine Gruppe dieser Zelle ist, richtig. |
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Außerdem haben wir hier Aktionsschaltflächen, die Ihnen dabei helfen, noch mehr Dinge zu tun. Wenn Sie zu UMAP wechseln möchten und dies bevorzugen, können Sie dies tun. Jetzt werden die Diagramme mit UMAP verknüpft. |
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Genau das Gleiche, aber UMAP bietet eine etwas bessere Trennung und kann eine globalere Struktur in der Visualisierung bewahren. Außerdem können wir Ihnen einige Möglichkeiten bieten, mit denen Sie eventuell vorhandene Zellen entfernen können |
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verunreinigt oder es gibt Qualitätsprobleme. Wenn uns hier beispielsweise eine Gruppe von Zellen nicht gefällt, können wir sie aus der Visualisierung entfernen. Machen Sie es sauberer, aber Sie können sie jederzeit zurückbringen. |
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Und wieder können wir die Diagramme teilen, was eine Schaltfläche zum Teilen von Diagrammen darstellt. Dieses Mal können wir nach Geschlecht aufteilen, wir teilen nach weiblich und männlich. Richtig, wir können das Niveau der Genexpression zwischen den Geschlechtergruppen vergleichen, was manchmal sehr nützlich ist. |
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Und wir sind gespalten. |
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Und auf der nächsten Registerkarte finden Sie weitere Visualisierungstools zur Visualisierung der Genexpressionsniveaus in den neun |
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Gruppen, neun Gruppenzellen, rechts. Daher wird der erste Teil als Violinplot bezeichnet. Auch hier haben wir einen Funktionsumschalter, der Ihnen dabei hilft |
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all diese Gene in verschiedenen Clustern, richtig. Jetzt können Sie je nach Höhe erkennen, wie hoch der Teil des Diagramms ist und welche Dichte er hat. |
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Sie können deutlich erkennen, wo diese Gene stark exprimiert werden. Als Beispiel geben wir noch einmal ein Beispiel: Ich verwende dieses Gen, GNLY. Sie können sehen, dass es in Cluster acht stark exprimiert wird. |
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Und in der Mitte ist das zweite Grundstück, das wir Ihnen zur Verfügung stellen, ein Kammgrundstück. Ein Kammgrundstück organisiert die |
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Cluster auf der Y-Achse und das Genexpressionsniveau auf der X-Achse. Aber im Grunde bietet es Ihnen etwas Ähnliches, je nachdem, was Ihnen gefällt. |
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Zum Beispiel GNLY, auch hier können wir sehen, dass Cluster acht GNLY stark durch Knoten oder andere Cluster ausdrückt. |
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Und unten haben wir einen weiteren Plot namens Punktplot. Dies ist die neue Handlung, die wir gerade zu diesem Bericht hinzugefügt haben. Das Punktdiagramm zeigt Ihnen nicht nur die Genexpressionsniveaus, sondern auch den Prozentsatz der Zellen, die dieses Gen exprimieren. Schauen Sie sich zum Beispiel diesen Ort an, |
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PPBP-Gen. Und wir können diesen Cluster sehen, in Cluster sieben, den wir hatten, können wir 100 % der Zellen in Cluster sieben sehen, die dieses PPBP-Gen exprimieren. Dieses Gen ist also das Markergen für |
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Eigentlich PPBP-Zellen. Es ist also ganz klar, dass es sich bei Cluster sieben um eine Blutzellenart handelt, nämlich eine PPBP-Zelle, und sie werfen einen Blick auf andere, wie zum Beispiel Cluster zwei. |
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Nur 12 % der Zellen exprimieren dieses Gen. Es kann also zu einer gewissen Kontamination kommen, aber bei dieser Zellgruppe handelt es sich definitiv nicht um PPBP-Zellen. Diese Handlung zeigt es Ihnen also nur |
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Das Expressionsniveau und der Expressionsprozentsatz in jedem Cluster, die zusätzliche Informationen im Diagramm bieten. |
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Daher ist die nächste Registerkarte auch sehr nützlich. Man nennt es Feature-Screening. Was ich gemacht habe, war ein Fading-Boosting-Forest-Algorithmus und die anschließende Verwendung dieser Gene zur Vorhersage der Cluster. Daher sind in dieser Tabelle die wichtigsten Gene aufgeführt, die zur Trennung der Zellen beigetragen haben. |
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Und der richtige Weg, diese Gene anzuzeigen, besteht darin, dieses Aktionsfeld zu öffnen. Sie wählen diese Top-35-Gene aus, die Sie visualisieren möchten. Sie klicken auf OK. |
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Auf der nächsten Registerkarte werden Ihnen also nur die 35 von Ihnen ausgewählten Gene angezeigt. Das sind also die Gene, größtenteils informativ. Rechts. Sie können es erklären |
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warum diese verschiedenen Zellgruppen getrennt sind. Also noch einmal: Wir wechseln einfach oder Sie können sich durchklicken und versuchen, die Muster zu erkennen. Und wenn Sie dann bemerken, gibt es viele Gene LYZ, |
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CST3 und NKG7. Diese liegen bereits in den Markergenen vor oder wurden bereitgestellt, was dieses Merkmalsscreening bedeutet |
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Diese Methode ist wirklich erfolgreich, um die wichtigsten Gene in Ihrem Datensatz zu erfassen. Und eine weitere Möglichkeit zur Visualisierung ist die GTEx-Datenbank. GTEx ist eine gewebespezifische Datenbank. |
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Sagen Sie Ihnen, welche Gene in welchem Gewebe Ihres menschlichen Körpers exprimiert werden. So können wir die Genliste direkt an die Datenbank senden. Klicken Sie einfach auf OK. Wir werden das öffnen |
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Website und GTEx-Website stellen Ihnen eine Heatmap zur Verfügung, also mit den Top-35-Genen. Jetzt können Sie sehen, wo ich in diesen beiden menschlichen Geweben und Organen ausgedrückt habe, was sehr praktisch ist, um zusätzliche Informationen anzuzeigen. |
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Jetzt, wo diese Markergene verwendet werden, können Sie wahrscheinlich erkennen, um welche Zellgruppe es sich handelt, richtig. Es gibt also einen |
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Die Funktion wird hier als Neukodierung bezeichnet. Was es bewirkt, ist, dass Sie es öffnen und diese Zahlen nun in tatsächliche Zellnamen umwandeln können, richtig. Achtes Beispiel: Wir wissen bereits, dass es sich um NK-Zellen handelt. Und wir können es tun ... Ich habe bereits Namen für jeden einzelnen von ihnen. Also tippe ich einfach ein |
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Diese |
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Monozit. |
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Zwei sind eigentlich Gleichstromzellen; Drei ist FCGR3A+-Monocit. |
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Dies sind naive CD+ T-Zellen. |
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Gruppieren Sie fünf Gedächtnis-CD4+-T-Zellen. |
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Und CD8+ T |
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Meijian Guan |
| Meijian Guan |
für Gruppe sechs; Sieben sind PPBP, wie wir bereits gesehen haben, und die neunte sind B-Zellen. |
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Bei dieser Neukodierung klicken wir also auf Neukodieren. Da nun alle Diagramme und Registerkarten miteinander verbunden sind, können Sie nun feststellen, dass alle Zahlen in tatsächliche Zellennamen geändert wurden. Es dient Ihnen lediglich zur Erkundung Ihrer Daten |
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ganz einfach, richtig. Sie können wissen, wo sich diese Zellen befinden, und Sie können erneut Erkundungen auf und in Ihren Parzellen durchführen. Und noch einmal, einschließlich dieser Cluster-Plots, sehen Sie, dass der benutzerdefinierte Name in die tatsächlichen Zellennamen geändert wurde. Ähm, also |
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Das war's mit dem heutigen Thema. Und wenn Sie Fragen haben, können Sie mir eine E-Mail senden oder eine Nachricht in der JMP-Community hinterlassen. Vielen Dank für Ihre Zeit. |
