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JMP® プロジェクトによる単一細胞 RNA シーケンス ワークフローの構築 (2020-US-30MP-603)

レベル: 中級

 

Meijian Guan、SAS、JMP 調査統計開発者

 

単一細胞 RNA シーケンス技術 (scRNA-seq) は、細胞の差異をより高い解像度で解析し、微小環境の状況における個々の細胞の機能をより深く理解できるようにします。 最近では、個々の免疫細胞の転写変化を特徴付けることにより、新型コロナウイルス感染症と戦うために使用されています。 ただし、その高次元性、疎性、および細胞集団間の不均一性の変化により、データの視覚化と分析において新たな課題も引き起こされます。 JMP プロジェクトは、データ テーブル、レポート、スクリプト、および外部ファイルを整理する新しい方法です。 このプレゼンテーションでは、scRNA-seq データセットに対して標準的な探索を実行する JMP プロジェクトを使用して、統合された Basic scRNA-seq ワークフローを作成する方法を示します。 まず、分散法または分散安定化変換 (VST) 法を使用して、可変性の高い遺伝子のセットを選択します。 次に、スパース SVD 分析を実行することで、データの次元とスパース性をさらに削減します。 次に、データ概要、可変遺伝子プロット、階層的クラスタリング、特徴重要度スクリーニング、および個々の遺伝子発現レベルの動的バイオリン プロットで構成される対話型レポートを生成します。 さらに、適切な R パッケージがインストールされている場合は、JMP の R 統合機能を利用して、細胞集団に対して t-SNE または UMAP の視覚化を実行します。

 

 

自動生成されたトランスクリプト...

 

スピーカー	成績証明書
メイジアン・グアン	よし。 えー、こんにちは、皆さん。 ご参加いただき誠にありがとうございました。 自分の作品をこのような機会に共有することができてとても嬉しいです
	JMPライフサイエンスグループおよびSAS Instituteと共同で研究を行っています。 したがって、今日のトピックは、JMP Project を使用して単一細胞 RNA シーケンスのワークフローを構築することになります。 これは、JMP Genomics 10 用に私が開発した新機能です。 JMP Genomics が何なのかわからない場合は、簡単に説明します。
	JMP プロジェクトは 14 日にリリースされた新機能であり、レポートの整理に役立つ非常に優れたツールです。 そこで私たちはこの新しいプラットフォームを利用して、単一細胞 RNA シーケンスを組織しました。
	ワークフローをそれに組み込みます。 まず最初に、JMP について少し背景を説明したいと思います。JMP Genomics は
	JMP ファミリの製品の 1 つは、SAS および JMP Pro 上に構築されています。 したがって、両方の製品を利用して、非常に強力な分析ツールを作成します。
	つまり、ゲノムデータ用に設計されているため、さまざまな種類のゲノムデータを読み取って、前処理を実行し、次世代シーケンシングの解析を処理できます。
	これは、差次的な遺伝子発現とバイオマーカーの発見に非常に優れており、多くの科学者が作物や家畜の育種にそれを使用しています。 したがって、これは非常に強力なツールです。 ゲノミクスに関連することをしている人はぜひチェックしてみてください。
	次に皆さんと共有したいのは、単一細胞 RNA シーケンスです。 あまり馴染みのない方も多いかもしれません。
	これは、個々の細胞のレベルでそれを調べるために使用される比較的新しい技術です。
	また、細胞グループの平均発現レベルを調査する従来の RNA シーケンス技術と比較します。
	この新しいテクノロジーは、細胞の違いをより高い解像度で解析し、微小環境の中での個々の細胞の機能をより深く理解できるようにします。
	そして、これは、新しく希少な細胞集団を発見したり、細胞発生の軌跡を追跡したり、細胞タイプ間で発現差が異なる遺伝子を特定したりするなど、多くのことを行うのに役立ちます。 したがって、非常に幅広い用途があります。
	最近の応用例の 1 つは、科学者が Covid 19 と戦うためにそれを使用していることです。
	免疫細胞の転写変化の特徴と、ワクチンと治療法の開発方法について説明します。 また、それに加えて、がん研究や免疫学、その他多くの研究分野でも広く使用されています。 うーん、とても強力なツールですが、
	そのデータを分析するにはいくつかの課題があるため、このワークフローをまとめました。
	単一細胞 RNA シーケンスのトップラインの概要を説明したいと思います。 ですから、まずサンプルを入手する必要があります。
	人間からでも、動物からでも。 それは腫瘍または臨床サンプルである可能性があります。 そして、それらのサンプルを個々のセルに分離できます。
	したがって、単離した後、すべての個々の細胞に対して、保有するすべての遺伝子の配列決定を行うことができます。 たとえば、人間には約 30,000 個の遺伝子があります。 したがって、最終的な成果物は、読み取りカウント テーブルでは次のようになります。 私たちは遺伝子を持っています...30,000 個の遺伝子が並んでいます。
	場合によっては約 50 万個のセルが列として使用されます。 ご覧のとおり、これらの非常に大規模なデータセットを満たすには、非常に高い次元が必要になります。 また、表内のゼロにも注目してください。
	技術的または生物学的な制限により、すべての細胞のすべての遺伝子を検出することはできません。 したがって、細胞の 90% が実際に存在することは珍しいことではありません。
	ゼロ。したがって、非常にまばらです。 単一細胞 RNA シーケンス データを分析する場合、疎性ももう 1 つの課題です。
	ただし、前処理、クリーンアップ、次元削減を行った後は、このデータに対してクラスタリングや主成分などの通常の遺伝子発現差解析を適用できます。 したがって、それらは私のワークフローで言及されます。
	そして、高次元性、高い疎性、さらには細胞集団間の不均一性の違いなどの課題に気づいたことはすでに述べました。
	非常に多くの異なるシーケンスプロトコルがあり、非常に多くの異なる分析パッケージがあるため、技術的なノイズと再現性。
	R や Python、その他のツールでは、正確な手順に従ってデータを分析するのは非常に困難です。 手順を混同したり、正しい順序で実行しなかったりすると、
	再現可能な結果が得られない場合があります。 これが、私たちがここで解決しようとした問題の 1 つです。
	単一細胞 RNA 配列データの例を示したいと思います。 このデータは私のデモンストレーションで使用され、血液サンプル データまたは ppm を削減したものです。 行に細胞があり、列に遺伝子があると言いましたが、
	約8000列と100
	行、つまりセルを意味します。 そして、ほとんどどこにでもゼロが見られます。 この特定のデータセットでは 90% 以上のスパース性があると思います。
	それでは、JMP Genomics 10 の新しい単一細胞 RNA シーケンス ワークフローには何が含まれているのでしょうか? このワークフローでは、それを構築しようとしました
	技術的な背景があまり良くなくても、コーディングの方法や統計情報を学ぶ時間がない人にとっては、 したがって、このワークフローでは、ユーザーがワークフロー内の他のステップを自動的に実行できるように、これらのステップを正しい順序に配置しています。 そして私たちも
	ユーザーがナビゲートしてパラメーターを変更し、さまざまな選択を確認できるようにする非常にインタラクティブなレポートを提供します。
	このワークフローには、データインポートの進行状況、前処理など、実際にこのワークフローのバックボーンとなる可変遺伝子選択メソッドが含まれています。
	したがって、可変遺伝子選択の場合、この方法の目標は遺伝子の次元を削減することです。
	なぜなら、人間のサンプルの場合、30,000 個の遺伝子があり、そのすべてが有益なわけではないからです。 したがって、最も有益なものを選択するように努めます。
	分散方法と
	最低回帰に基づく変動安定化変換法。 したがって、詳細については説明しませんが、これら 2 つの方法は研究コミュニティで広く使用されており、それらを再現できたことを非常に嬉しく思います。
	また、スパース SVD を適用して次元をさらに削減します。 そこで、階層的クラスタリングも適用しました。ak はクラスタリングを意味します。
	JMP にはブースティング フォレスト手法を使用した機能重要度スクリーニングがあり、R パッケージがインストールされている場合は、T-SNE と UMAP 視覚化を直接呼び出します。
	これは、単一細胞 RNA シーケンス解析を使用することで非常に一般的です。 また、バイオリン プロット、リッジライン プロット、DOP プロットなどの動的視覚化も提供しました。また、差次的な遺伝子発現も行っています。 したがって、すべてのレポートは、JMP プロジェクトと非常に統合されたレポートに編成されます。
	ということで、次はデモをしてみます。 このデモには 2 つの目標があります。 最初の 1 つは、この PBMC データ セット内の細胞集団を分類することです。 このデータセット内の細胞の種類を見つけようとします。 2 番目の目標は、サブタイプや状態全体で発現の異なるジーンズを特定することです。
	それではまず、JMP Genomics スターターに行きましょう。 したがって、JMP Genomics インターフェースは通常の JMP とはかなり異なって見えますが、
	ナビゲートするのはとても簡単です。 ワークフローの基本を知りたい場合
	基本的な単一細胞 RNA シーケンスのワークフローがここにあり、クリックするとこのインターフェイスが表示されます。 したがって、インターフェイスは非常に直感的です。 データセットを提供するだけだと思います。
	そして、QC オプションを指定します。 分析および可変遺伝子の選択のために、何を、どのような種類の遺伝子または細胞を除去する必要がありますか。 どちらの方法を使いたいか、そうでしょう。 VST を選択した場合は、保持する遺伝子の数 (2000 または 3000) を指定することもできます。
	そして、クラスタリング オプション、つまり、クラスタリングに使用する主成分の数と、
	階層型にするか、k がクラスタリング アルゴリズムを意味するかのどちらかです。 選択肢が増えれば増えるほど、マーカー遺伝子が得られます
	細胞集団を識別するために使用するマーカー遺伝子のリストを追加するのに役立ちます。これは、ここでは非常に便利なツールです。 また、ANOVA や発現差分析を開始することもできます。 ということで、これは別レポートです。
	この話ではこれについては説明しません。 それで、もう一つあったのが実験例ですね。 基本的に治療情報などスタートデザインに関する情報なら何でも提供していただけると付け加えますと、
	セックス情報。 それで、これは
	シミュレーションデータはこちら。 グループ間の遺伝子発現レベルとさまざまな測定値をどのように比較するかを示したいと思います。
	そして最後に、t-SNE または UMAP R パッケージがインストールされている場合にそれらを呼び出すことができる埋め込みオプションがあります。 このためのさまざまなパラメータをアルゴリズムに変更できます。
	これらのオプションをすべて指定したら、実行するだけで、次のようなレポートが得られます。 これは
	表形式のレポート。 このレポートには合計 7 つのタブがあります。 見たい順に並べてみました
	遺伝子は何個入っているのか
	細胞内の読み取り数、データ内のミトコンドリア遺伝子数の割合、およびこの 3 つの測定値間の相関関係。
	そして、この左側にアクション ボックスがあることに気づきました。 これを展開してオプションを見つけると、このボックスでさまざまな操作を行うことができます。
	このタブでは、具体的には、実験計画ファイルで指定した条件に基づいてグラフを分割できます。 たとえば、治療を行って別れることができます。
	薬剤 1、薬剤 2、プラセボ。 そうすれば、異なるグループ間に違いがあるかどうかがわかります。元のプロットに戻りたい場合は分割を解除できます。
	2 番目のタブは可変遺伝子選択で、これがこのワークフローの根幹です。 赤い点は、その後の分析のために私が選択した遺伝子を意味します。
	灰色の点は、分析で破棄される遺伝子です。 アクション ボックスを展開すると、VST を使用しているため、2000 個の遺伝子を指定したことがわかります。
	この分析では。 しかし、気が変わったら、いつでも、別の数の遺伝子を入力して [OK] をクリックすることができます。 したがって、この新しい番号に基づいてすべてのタブが更新されます。
	したがって、可変遺伝子のリストを取得した後、主成分分析に相当するスパース SVD 分析を実行して次元をさらに削減します。
	したがって、SVD 分析を適用した後、上位 2 つの SVD または主成分をプロットできます。 データセットのグローバル構造を確認してみてください。
	したがって、この場合、このデータセットには 2 つの大きなグループがあることがわかりますが、これは興味深いことです。 さらに調査を進めるのに役立つ 3D プロットも提供します。
	あなたのデータ。 場合によっては、2D プロットでは特定できない洞察が存在することもあります。 3D プロットは、実際に追加の価値を提供できる場合があります。
	選択した数 (20 または 30) に応じて、これらの SVD があり、次の目的で使用できます。
	クラスタリングを実行します。 この場合、階層的クラスタリングを選択したところ、データ セット内に 9 つのクラスターが見つかりました。
	デンドグラムに加えてコンスタレーションプロットも提供しています
	このプロットは t-SNE や UMAP に似ているので、とても気に入っています。 これにより、異なるグループ間の距離についてより適切なアイデアが得られます。
	たとえば、3 つのグループ、大きなグループ、3 つのクラスターがあるとします。
	他のグループとは一線を画す存在。 ここで、それらがグローバル構造のどこにあるかを確認したい場合は、これが私が検出した上位 3 つのクラスターです。 3D プロットを見るとわかります。
	強調表示されているものはすべてここにあります。 そして、再び 2D に戻ります。これは、強調表示した 2 つの大きなクラスターのうちの 1 つです。そのため、インタラクティブ性が非常に役立ちます。
	さまざまな方法でデータを観察して視覚化します。 また、さまざまなグループにわたるさまざまなパターンをさらに特定するのに役立つ平行プロットも提供します。
	次のタブは埋め込みです。これは、R パッケージがインストールされている場合、t-SNE および UMAP パーツを意味します。 私はします
	R を呼び出して分析を実行し、データを戻して JMP で視覚化します。 これが t-SNE プロットです。 9 つのクラスターが非常にうまく分離されています。
	一番下はまったく同じプロットですが、今回は提供されたマーカー遺伝子で色を付けました。 14 個のマーカー遺伝子があります。 この機能を使用すると、クリックスルーに切り替えることができます
	これらの遺伝子がどこで発現しているかを確認するためです。 たとえば、この小さなクラスターで高度に発現している GNLY 遺伝子がありますが、データは何だろうかと考えています。 選択して戻ると、すべてが表示されます。そのほとんどはクラスター 9 とクラスター 8 のものです。
	つまり、GNLYはNK細胞の遺伝子です。 NK細胞のマーカー遺伝子です。 これで、この細胞のグループが何であるかがわかりました。
	また、ここにはアクション ボタンもあり、より多くのことを行うのに役立ちます。 UMAP に切り替えたい場合は、切り替えても構いません。 これで、プロットが UMAP に関連付けられます。
	まったく同じことですが、UMAP を使用すると、分離が少しだけ向上し、視覚化でよりグローバルな構造を保持できます。 また、可能性のある細胞を除去するのに役立ついくつかの方法も提供します。
	汚染されているか、品質に問題がある。 たとえば、ここではセルのグループが気に入らないので、それらを視覚化から削除できます。 きれいにしますが、いつでも元に戻すことができます。
	また、グラフ分割ボタンを使用して、プロットを分割することができます。 今回は性別で分けることができ、女性、男性で分けました。 そうですね、性別グループ全体で遺伝子発現レベルを比較することができます。これは場合によっては非常に便利です。
	そして私たちは分裂してしまいました。
	次のタブでは、9 つの遺伝子発現レベルを視覚化するためのさらに多くの視覚化ツールが提供されます。
	グループ、9 つのグループ セル、右。 したがって、最初の部分はヴァイオリンプロットと呼ばれます。 繰り返しますが、操作を支援する機能スイッチャーがあります。
	これらすべての遺伝子は異なるクラスターにあります。 これで、方法に応じて、グラフの部分の高さと密度がどのくらいになるかを確認できます。
	これらの遺伝子が高度に発現している場所がはっきりとわかります。 たとえば、ここでも私がこの遺伝子 GNLY を使用している例を挙げますが、クラスター 8 で高度に発現していることがわかります。
	そして真ん中に、私たちが提供している2番目のプロットは尾根プロットです。 稜線プロットが整理されています。
	Y 軸はクラスター、X 軸は遺伝子発現レベルです。 ただし、基本的には好みに応じて同様のものを提供します。
	たとえば、GNLY についても、クラスター 8 には、ノットまたは他のクラスターによって高度に発現された GNLY があることがわかります。
	そして一番下には、ドットプロットと呼ばれる別のプロットがあります。 これは、このレポートに追加したばかりの新しいプロットです。 ドット プロットでは、遺伝子発現レベルを表示するだけでなく、その遺伝子を発現している細胞の割合も表示できます。 たとえば、この場所を見てください。
	PPBP遺伝子。 そして、このクラスターを見ることができます。私たちが得たクラスター 7 では、クラスター 7 の細胞の 100% がこの PPBP 遺伝子を発現していることがわかります。 したがって、この遺伝子は、
	実はPPBP細胞。 これで、クラスター 7 が PPBP 細胞という血球の 1 つのタイプであり、クラスター 2 などの他の細胞を調べていることが非常に明らかです。
	この遺伝子を発現している細胞はわずか 12% です。 したがって、多少の汚染はあるかもしれませんが、この細胞グループは明らかに PPBP 細胞ではありません。 このプロットはあなたに示しているだけです
	各クラスターの発現レベルと発現パーセンテージは、プロットに追加情報を提供します。
	したがって、次のタブも非常に便利です。 それは機能スクリーニングと呼ばれます。 私がやったのは、フェージング ブースティング フォレスト アルゴリズムと、その遺伝子を使用してクラスターを予測することでした。 したがって、細胞の分離に寄与した最も重要な遺伝子がこの表にランク付けされています。
	これらの遺伝子を表示する正しい方法は、このアクション ボックスを開くことです。 視覚化したい上位 35 個の遺伝子を選択します。 「OK」をクリックします。
	したがって、次のタブには、選択した 35 個の遺伝子のみが表示されます。 これらは遺伝子であり、ほとんどが有益です。 右。 彼らは説明できる
	なぜこれらの異なる細胞グループが分離されるのか。 繰り返しますが、単に切り替えるか、クリックしてパターンを確認してみてください。 そして気が付けばそこにはLYZという遺伝子がたくさんあり、
	CST3とNKG7。 それらはすでにマーカー遺伝子に含まれているか、提供されています。つまり、この機能スクリーニングが意味します。
	この方法は、データセット内の最も重要な遺伝子を検出するのに非常に成功しています。 もう 1 つは、GTEx データベースを使用して視覚化を行うことができます。 GTEx は組織固有のデータベースです。
	人体のどの組織でどの遺伝子が発現しているかを教えてください。 したがって、遺伝子リストをデータベースに直接送信できます。 「OK」をクリックするだけです。 を開きます。
	Web サイトと GTEx Web サイトでは、上位 35 個の遺伝子を含むヒート マップが提供されます。 これで、これら 2 つの人間の組織、器官のどこに発現したかがわかり、追加情報を確認するのに非常に便利です。
	さて、これらのマーカー遺伝子が使用されているので、おそらくそれがどの細胞グループであるかを特定できるでしょう。 それで、1つあります
	ここでの関数はrecodeと呼ばれます。 これを開くと、数値を実際のセル名に再コード化できるようになります。 たとえば、8つはNKであること、NK細胞であることはすでにわかっています。 そして、私たちにはできるのです...私はすでにそれらすべての名前を持っています。 だから私はただ入力するだけです
	それらの
	モノサイト。
	2 つは実際には DC セルです。 3 つは FCGR3A+ モノサイトです。
	これらはナイーブ CD+ T 細胞です。
	5 つのメモリー CD4+ T 細胞をグループ化します。
	そしてCD8+T
	メイジアン・グアン
メイジアン・グアン	グループ6の場合。すでに見たように、7 番目は PPBP、9 番目は B 細胞です。
	したがって、これらの再コードを使用して、「再コード」をクリックします。 すべてのプロットとタブが接続されたので、すべての数値が実際のセル名に変更されたことがわかります。 つまり、データを探索するのに役立つだけです
	簡単です、そうです。 これらのセルがどこにあるのかを知ることができ、プロット上およびプロット内で再度探索を行うことができます。 このクラスタリング プロットも含めて、カスタム名が実際のセル名に変更されていることがわかります。 えー、それで
	今日のテーマはここまでです。 ご質問がございましたら、私に電子メールを送信するか、JMP コミュニティにメッセージを残してください。 お忙しいところありがとうございました。

起こるデータ探索データの視覚化