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使用 JMP® 项目构建单细胞 RNA 测序工作流程 (2020-US-30MP-603)

级别：中级

 

Meijianguan，JMP 研究统计师开发人员，SAS

 

单细胞 RNA 测序技术 (scRNA-seq) 可提供更高分辨率的细胞差异，并更好地了解单个细胞在其微环境中的功能。 最近，它已被用于通过表征个体免疫细胞的转录变化来对抗 COVID-19。 然而，由于其高维性、稀疏性和不同细胞群的异质性，它也给数据可视化和分析带来了新的挑战。 JMP Project 是一种组织数据表、报告、脚本以及外部文件的新方法。 在本演示中，我将展示如何使用 JMP Project 创建集成的基本 scRNA-seq 工作流程，对 scRNA-seq 数据集执行标准探索。 它首先使用分散或方差稳定变换（VST）方法选择一组高变异基因。 然后通过执行稀疏 SVD 分析进一步降低数据维度和稀疏性。 然后，它生成一份交互式报告，其中包括数据概述、可变基因图、层次聚类、特征重要性筛选和单个基因表达水平的动态小提琴图。 此外，如果安装了适当的 R 软件包，它还利用 JMP 中的 R 集成功能对细胞群执行 t-SNE 或 UMAP 可视化。

 

 

自动生成的成绩单...

 

扬声器	成绩单
关美健	好的。 嗯，大家好。 非常感谢您参加这次演讲。 我很高兴有这个机会分享我的工作
	一直与 JMP 生命科学集团和 SAS 研究所合作。 今天的主题是使用 JMP Project 构建单细胞 RNA 测序工作流程。 这是我为 JMP Genomics 10 开发的新功能。 如果您不知道什么是 JMP Genomics，我将向您简单介绍一下
	关于它的概述和JMP项目是一个新功能，于14日发布，它是一个非常好的工具，可以帮助您组织报告。 所以我们利用这个新平台组织了一个单细胞RNA测序
	工作流程进入其中。 首先，我想向您介绍一下 JMP 的背景知识，JMP Genomics 是
	JMP 系列产品之一基于 SAS 和 JMP Pro 构建。 因此，它利用了这两种产品，从而形成了非常强大的分析工具。
	所以它是为基因组数据设计的，所以它可以读取不同类型的基因组数据，它可以进行预处理，它可以处理下一代测序分析。
	它非常擅长差异基因表达和生物标志物发现，许多科学家将其用于农作物和牲畜育种。 所以它是一个非常强大的工具。 如果你正在做任何与基因组学相关的事情，我鼓励每个人都检查一下。
	接下来我想跟大家分享的是单细胞RNA测序。 很多人可能对它不是很熟悉。
	因此，这是一项相对较新的技术，用于在单个细胞的水平上进行检查。
	并与传统的RNA测序技术所测量的一组细胞的平均表达水平进行比较。
	这项新技术提供了更高分辨率的细胞差异，让您更好地了解单个细胞在其微环境中的功能。
	它可以帮助做很多事情，比如发现新的和稀有的细胞群，跟踪细胞发育的轨迹，以及识别细胞类型之间差异表达的基因。 所以它的应用非常广泛。
	最近的一项应用是科学家用它来对抗 Covid 19，因为它可以用来
	描述免疫细胞转录变化的特征以及如何开发疫苗和治疗方法。 除此之外，它还广泛应用于癌症研究、免疫学和许多其他研究领域。 嗯，所以它是非常强大的工具，但是
	分析这些数据确实面临一些挑战，所以这就是我们整合这个工作流程的原因。
	只是想向您概述单细胞 RNA 测序的要点。 所以你需要做的第一件事就是获取样品，
	来自人类或动物。 它可能是肿瘤或实验室样本。 然后您可以将这些样本分离到单个细胞中。
	因此，分离后，您可以对每个细胞的所有基因进行测序。 例如，人类大约有 30,000 个基因。 所以最终的产品在我们的阅读计数表中将如下所示。 我们有基因...30,000 个基因排成一行，我们有
	有时大约有五十万个细胞作为列。 所以正如你所看到的，满足这些非常大的数据集具有非常高的维度。 您还可以注意到表中的零，因为
	由于技术或生物学的限制，我们无法检测每个细胞中的每个基因。 因此，90% 的细胞实际上是
	零。所以它非常稀疏。 分析单细胞 RNA 测序数据时，稀疏性是另一个挑战。
	但是，在进行预处理、清理和降维之后，您可以对该数据应用常规分析（例如聚类和主成分、差异基因表达分析）。 所以这些会在我的工作流程中提到。
	我已经提到过，我注意到了挑战，包括高维度、高稀疏性，以及细胞群体之间存在不同的异质性。
	技术噪音和重现性，因为有如此多不同的测序方案，有如此多不同的分析包。
	在 R 或 Python 或其他工具中，您很难按照准确的步骤来分析数据。 如果你混淆了步骤并且没有按照正确的顺序做事，
	您可能无法获得可重复的结果。 这就是我们试图解决的问题之一。
	只是想向您展示一个单细胞 RNA 测序数据的示例。 该数据将在我的演示中使用，它是减少的血液样本数据或 ppm。 看到我说过我们有行中的细胞和列中的基因，所以它是
	约8000列和100
	行，这意味着单元格。 你几乎到处都可以看到这些零。 我，我相信这个特定数据集中有超过 90% 的稀疏性。
	那么 JMP Genomics 10 中新的单细胞 RNA 测序工作流程有哪些内容？ 所以对于这个工作流程，我们尝试构建它
	对于那些没有很好的技术背景或没有很好的人来说，没有时间学习如何编码和所有这些统计数据。 因此，在此工作流程中，我们将这些步骤按照正确的顺序排列，以便用户自动执行工作流程中的其他步骤。 而我们也
	提供互动性很强的报告，帮助用户与我们一起导航、更改参数并检查不同的选择。
	那么这个工作流程中包括数据导入进度、预处理以及我们有一个可变基因选择方法，这实际上是这个工作流程的支柱。
	因此，对于可变基因选择，该方法的目标是减少基因的维度。
	因为对于人类样本来说，我们有 30,000 个基因，但并非所有基因都有信息。 因此，我们尝试选择信息最丰富的内容。
	分散法和
	基于最低回归的变异稳定变换方法。 所以，我不会详细介绍，但这两种方法在研究界广泛使用，我很高兴我们能够重现它们。
	我们还应用稀疏 SVD 来进一步降低维度。 因此我们还应用了层次聚类和 ak 均值聚类。
	我们在 JMP 中使用增强森林方法进行特征重要性筛选，如果您安装了 R 软件包，我们将直接调用 T-SNE 和 UMAP 可视化
	单细胞 RNA 测序分析非常流行。 我们还提供了一些动态可视化，包括小提琴图、山脊线图、dop 图；我们还进行差异基因表达。 因此，所有报告都将与 JMP 项目组织在一个非常集成的报告中。
	那么接下来我会做一个demo。 该演示有两个目标。 第一个是对该 PBMC 数据集中的细胞群进行分类。 我们尝试找出该数据集中的细胞类型。 第二个目标是识别不同亚型和条件下差异表达的牛仔裤。
	首先，我们先来看看 JMP Genomics 入门版。 因此，JMP Genomics 界面看起来与常规 JMP 有很大不同，但是
	它很容易导航。 如果您想了解工作流程基础知识
	基本的单细胞RNA测序工作流程就在这里，你点击就可以调出这个界面。 所以界面非常直观。 我会说你只提供一个数据集。
	您还可以指定 QC 选项。 您想要去除什么、什么类型的基因或细胞以进行分析和可变基因选择。 你想用哪一种方法，对吧。 如果选择VST，还可以指定要保留的基因数量，2000或3000
	以及聚类选项，对吧，您想要使用多少个主成分进行聚类，以及
	要么您需要分层算法，要么需要 k 表示聚类算法。 选择越多，我们就有标记基因
	帮助您添加要用于识别细胞群的标记基因列表，这是非常方便的工具。 您还可以启动方差分析和差异表达分析。 所以这是一份单独的报告。
	我不会在这次演讲中讨论这个问题。 所以我们的另一件事是实验示例，对吧。 如果您补充说，基本上您可以提供与开始设计相关的任何信息，例如治疗信息，
	性信息。 所以这是
	这里的模拟数据。 我只是想向您展示我们如何比较基因表达水平和组间的不同测量结果。
	最后，我们有嵌入选项，如果您安装了 t-SNE 或 UMAP R 软件包，可以调用它们。 您可以为此更改我们算法的不同参数。
	因此，在指定所有这些选项后，只需运行即可，然后您将获得如下所示的报告。 所以这是一个
	表格报告。 该报告共有七个选项卡。 我按照你想要的顺序组织了它们
	有多少个基因
	细胞中的读取计数或线粒体基因计数在数据中所占的百分比是多少，以及这三个测量值之间的相关性。
	你注意到左边，我们有操作框。 您可以展开它并在其中找到选项，在这个框中您可以用它做很多事情。
	具体来说，在此选项卡中，您可以根据实验设计文件中提供的条件分割图表。 例如，我们可以进行一次治疗，然后分开
	药物 1、药物 2、安慰剂。 然后你可以看看不同组之间有没有什么区别，对吧，如果你想回到我们原来的剧情我们可以不分裂。
	第二个选项卡是可变基因选择，这是该工作流程的支柱。 红点表示我选择用于后续分析的基因，这些
	灰点是在分析中将被丢弃的基因。 如果展开操作框，您可以看到，由于我们使用 VST，所以我们指定了 2000 个基因
	在这个分析中。 但如果你改变主意，你可以，你可以，每当你改变主意时，你都可以输入不同数量的基因，然后单击“确定”。 因此，所有选项卡都将根据这个新数字进行刷新。
	所以当你有了可变基因列表后，你要做的就是通过进行稀疏SVD分析来进一步降低维度，这相当于主成分分析。
	因此，应用 SVD 分析后，您可以绘制出前两个 SVD 或主成分。 尝试检查数据集的全局结构。
	所以在这个例子中，我们可以看到这个数据集中有两大组，这很有趣。 我们还提供了 3D 图来帮助您进一步探索
	您的数据。 有时，有一些你无法、无法在二维图中识别的见解； 3D 绘图有时确实可以提供额外的价值。
	我们有这些 SVD，根据您选择的数量（20 或 30），您可以使用它们
	执行聚类。 在本例中，我们选择了层次聚类，并在您的数据集中找到了 9 个聚类。
	除了树状图之外，我们还提供星座图
	我真的很喜欢，因为这个图与 t-SNE 或 UMAP 类似。 它可以让你更好地了解不同群体之间的距离，对吧。
	比如有三组，大组，三簇
	与其他群体有点不同。 如果您想查看它们在全局结构中的位置，这是我检测到的前三个集群。 看看 3D 图，我们可以看到
	所有突出显示的都在这里。 然后再次进入 2D，这是两个大集群之一，你知道，我说过我强调了这一点，所以它的交互性确实可以帮助你
	以多种方式观察和可视化您的数据。 我们还提供了一个平行图来帮助您进一步识别不同群体之间的不同模式。
	下一个选项卡是嵌入，这意味着如果您安装了 R 包装，则意味着 t-SNE 和 UMAP 部分。 我会
	调用 R、运行分析、带回数据并在 JMP 中进行可视化。 这是一个 t-SNE 图。 我们有九个簇，很好地分开。
	底部是完全相同的图，但这次我用您提供的标记基因对它们进行了着色；我们有 14 个标记基因。 因此您可以使用此功能切换到点击
	看看这些基因在哪里表达，对吧。 例如，有一个 GNLY 基因，在这个小簇中高度表达，我们想知道，我们的数据是什么？ 我们选择并返回，现在我们看到了所有，其中大多数来自簇九、簇八。
	所以GNLY是NK细胞的一个基因。 这是 NK 细胞的标记基因。 现在我们知道这个细胞群是什么了，对吧。
	我们这里还有操作按钮，可以帮助您做更多事情。 如果您想切换到 UMAP，如果您愿意的话，您可以这样做。 现在这些图与 UMAP 相关联。
	完全相同的事情，但 UMAP 确实为您提供了更好的分离，并且它可以在可视化中保留更多的全局结构。 我们还可以提供一些方法来帮助您去除可能存在的细胞。
	被污染或有质量问题。 例如，我们不喜欢这里的一组单元格，我们可以将它们从可视化中删除。 让它变得更干净，但你随时可以把它们带回来。
	同样，我们可以分割图，这是一个分割图按钮。 这次，我们可以按性别来划分，我们按女性、男性来划分。 是的，我们可以比较不同性别群体的基因表达水平，这有时非常有用。
	我们是分裂的。
	下一个选项卡为您提供更多可视化工具，以可视化九个基因的基因表达水平
	组，九组细胞，右。 所以第一部分被称为小提琴情节。 同样，我们有一个功能切换器可以帮助您完成
	所有这些基因都在不同的簇中，对吧。 现在您可以根据高度来查看图形部分的高度及其密度。
	您可以清楚地看到这些基因在哪里高度表达。 例如，我们再次举个例子，我正在使用这个基因，GNLY，你可以看到它在簇八中高度表达。
	在中间，我们为您提供的第二个图是山脊线图。 山脊线图正在组织
	Y 轴为聚类，X 轴为基因表达水平。 但它基本上是根据你的喜好为你提供类似的东西。
	例如，GNLY，我们再次可以看到簇八的 GNLY 被结或其他簇高度表达。
	底部我们有另一个图，称为点图。 这是我们刚刚添加到本报告中的新图。 除了显示基因表达水平之外，点图还可以显示表达该基因的细胞的百分比。 例如，看看这个地方，
	PPBP基因。 我们可以看到这个簇，在我们拥有的簇七中，我们可以看到簇七中 100% 的细胞表达这个 PPBP 基因。 所以这个基因是标记基因
	实际上是PPBP细胞。 现在很清楚，第七簇是一种血细胞，即 PPBP 细胞，他们会检查其他细胞，例如第二簇。
	只有 12% 的细胞表达该基因。 所以可能存在一些污染，但这组细胞绝对不是PPBP细胞。 所以这个情节只是向你展示
	每个簇中的表达水平和表达百分比，在图中提供了附加信息。
	所以下一个选项卡也非常有用。 这称为特征筛选。 我所做的是衰落增强森林算法，然后使用该基因来预测簇。 因此，有助于细胞分离的最重要基因在此表中排名。
	查看这些基因的正确方法是打开这个操作框。 您可以选择想要可视化的前 35 个基因。 单击“确定”。
	因此，下一个选项卡将仅显示您选择的 35 个基因。 这些就是基因，其中大部分信息是基因。 正确的。 他们，他们可以解释
	为什么这些不同的细胞群被分开。 再说一遍，我们只是切换，或者您可以点击并尝试查看模式。 然后如果你注意到的话，有很多基因 LYZ，
	CST3 和 NKG7。 这些已经在标记基因中或已提供，这意味着该特征筛选
	方法确实成功地提取了数据集中那些最重要的基因。 另一件事，你可以通过 GTEx 数据库进行可视化。 GTEx 是一个组织特异性数据库。
	告诉您哪些基因在人体的哪些组织中表达。 所以我们可以直接将基因列表发送到数据库。 您只需单击“确定”即可。 我们将打开
	网站和 GTEx 网站将为您提供热图，对吧，所以有前 35 个基因。 现在你可以看到我在这两个人体组织、器官中表达的位置，非常方便看到附加信息。
	现在我们已经使用了这些标记基因，您可能可以识别它们是哪一组细胞，对吧。 所以有一个
	这里的函数称为重新编码。 它的作用是，你打开它，现在你可以将这些数字重新编码为实际的单元格名称，对吧。 例如，八个我们已经知道它是NK，它是NK细胞。 我们可以做……我已经为他们每个人起了名字。 所以我只需输入
	那些
	铍石。
	两个实际上是DC电池；三是FCGR3A+单石。
	这些是原始 CD+ T 细胞。
	第五组记忆 CD4+ T 细胞。
	和CD8+T
	关美健
关美健	对于第六组；正如我们已经看到的，第七个是 PPBP，第九个是 B 细胞。
	因此，通过这些重新编码，我们单击“重新编码”。 现在，由于所有绘图和选项卡都已连接，现在您可以发现所有数字都已更改为实际的单元格名称。 所以它只是帮助你探索你的数据
	很容易，对吧。 您可以知道这些单元格在哪里，并且可以再次在绘图上和绘图中进行一些探索。 再说一次，包括这个聚类图，您知道，看到自定义名称已更改为实际的单元格名称。 嗯，所以
	今天的主题就到此为止。 如果您有任何疑问，可以给我发送电子邮件或在 JMP 社区上留言。 非常感谢您的参与。

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