Conférencier
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Transcription
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| Guan Meijian |
D'accord. Euh, salut à tous. Merci beaucoup d'avoir assisté à cette présentation. Je suis tellement heureux d'avoir cette opportunité de partager le travail que j'ai |
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ont travaillé avec le groupe JMP Life Science et le SAS Institute. Le sujet d'aujourd'hui va donc consister à créer un flux de travail de séquençage d'ARN unicellulaire avec le projet JMP. Il s'agit donc d'une nouvelle fonctionnalité que j'ai développée pour JMP Genomics 10. Si vous ne savez pas ce qu'est JMP Genomics, je vais vous donner un bref aperçu |
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un aperçu de celui-ci et du projet JMP est une nouvelle fonctionnalité, sortie le 14 et c'est un très bel outil qui peut vous aider à organiser vos rapports. Nous avons donc profité de cette nouvelle plateforme et organisé une étude de séquençage d'ARN unicellulaire |
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flux de travail dans celui-ci. Tout d'abord, je voudrais juste vous donner un petit aperçu de JMP. JMP Genomics est |
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l'un des produits de la famille JMP est construit sur SAS et JMP Pro. C'est donc tirer parti des deux produits que l'on obtient un outil analytique très puissant. |
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Il est donc conçu pour les données génomiques, il peut donc lire différents types de données génomiques, il peut effectuer un prétraitement, il peut gérer le séquençage de nouvelle génération de cette analyse. |
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Il est vraiment efficace pour l’expression différentielle des gènes et la découverte de biomarqueurs, et de nombreux scientifiques l’utilisent pour l’élevage et l’élevage. C'est donc un outil très puissant. J'encourage tout le monde à le vérifier si vous faites quelque chose en rapport avec la génomique. |
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Et la prochaine chose que je veux partager avec vous est le séquençage de l’ARN unicellulaire. Beaucoup d’entre vous ne le connaissent peut-être pas très bien. |
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Il s’agit donc d’une technologie relativement nouvelle utilisée pour examiner cela au niveau de cellules individuelles. |
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Et en comparant à la technologie traditionnelle de séquençage d’ARN qui enquête, le niveau d’expression moyen d’un groupe de cellules. |
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Cette nouvelle technologie offre une résolution plus élevée des différences cellulaires et vous permet de mieux comprendre la fonction de chaque cellule individuelle dans le contexte de son micro-environnement. |
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Et cela peut aider à faire beaucoup de choses comme découvrir des populations cellulaires nouvelles et rares, suivre les trajectoires de développement cellulaire et identifier les gènes exprimés différemment entre les types de cellules. Son application est donc très large. |
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Une application récente est que les scientifiques l'utilisent pour lutter contre le Covid 19, car il peut être utilisé pour |
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caractériser les changements transcriptionnels dans les cellules immunitaires et comment développer les vaccins et les traitements. En plus de cela, il est largement utilisé dans la recherche sur le cancer, en immunologie et dans de nombreux autres domaines de recherche. Euh, c'est donc un outil très puissant, mais |
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l'analyse de ces données présente certains défis, c'est pourquoi nous avons mis en place ce flux de travail. |
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Je voulais juste vous donner un aperçu de la ligne supérieure du séquençage de l’ARN unicellulaire. Donc la première chose dont vous avez besoin est d'obtenir un échantillon, |
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soit de l'homme, soit de l'animal. Il peut s'agir d'une tumeur ou d'un échantillon de laboratoire. Et puis vous pouvez isoler ces échantillons dans des cellules individuelles. |
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Ainsi, après avoir isolé, vous pouvez effectuer un séquençage sur chaque cellule individuelle pour tous les gènes dont vous disposez. Par exemple, chez l’humain, nous avons environ 30 000 gènes. Le produit final ressemblera donc à ceci dans notre tableau du nombre de lectures. Nous avons des gènes... 30 000 gènes en rangées et nous avons |
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environ parfois un demi-million de cellules sous forme de colonnes. Comme vous pouvez le constater, la satisfaction de ces très vastes ensembles de données revêt des dimensions très élevées. Vous pouvez également remarquer les zéros dans le tableau car |
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En raison des limitations techniques ou biologiques, nous ne pouvons pas détecter chaque gène dans chaque cellule. Il n'est donc pas rare de voir 90 % des cellules |
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des zéros. C'est donc très clairsemé. La parcimonie est un autre défi lorsque vous analysez les données de séquençage d’ARN unicellulaire. |
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Mais après avoir effectué le prétraitement, le nettoyage et la réduction des dimensions, vous pouvez appliquer régulièrement, comme le clustering et les composants principaux, une analyse différentielle de l'expression génique sur ces données. Ceux-ci seront donc mentionnés dans mon workflow. |
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Et j'ai déjà mentionné que j'avais remarqué des défis, notamment une dimensionnalité élevée, une parcimonie élevée, ainsi qu'une hétérogénéité variable entre les populations cellulaires. |
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Bruits techniques et reproductibilité, car il existe tant de protocoles de séquençage différents, tant de packages analytiques différents. |
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En R, Python ou d'autres outils, il est très difficile pour vous de suivre les étapes exactes pour analyser vos données. Et si vous avez mélangé les étapes et n'avez pas fait les choses dans le bon ordre, |
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vous ne pourrez peut-être pas obtenir des résultats reproductibles. C'est donc l'un des problèmes que nous avons essayé de résoudre ici. |
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Je veux juste vous montrer un exemple de données de séquençage d’ARN unicellulaire. Ces données seront utilisées dans ma démonstration et il s'agit de données d'échantillon de sang réduites ou ppm. Vous voyez, j'ai dit que nous avons des cellules en lignes et des gènes en colonnes, donc c'est |
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environ 8000 colonnes et 100 |
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lignes, ce qui signifierait des cellules. Et vous pouvez voir ces zéros un peu partout. Je, je crois que c'est plus de 90 % de rareté dans cet ensemble de données spécifique. |
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Alors, que contient notre nouveau flux de travail de séquençage d'ARN unicellulaire dans JMP Genomics 10 ? Donc pour ce workflow, nous avons essayé de le construire |
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pour ceux qui n'ont pas de très bonnes connaissances techniques ou qui n'ont pas le temps d'apprendre à coder et toutes ces statistiques. Ainsi, dans ce flux de travail, nous mettons ces étapes dans le bon ordre pour que les utilisateurs exécutent automatiquement les autres étapes du flux de travail. Et nous aussi |
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fournir des rapports très interactifs pour aider les utilisateurs à naviguer avec nous, à modifier les paramètres et à consulter différentes sélections. |
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Alors, qu'y a-t-il dans ce flux de travail, y compris la progression de l'importation des données, le prétraitement et nous avons une méthode de sélection de gènes variables, qui est en fait l'épine dorsale de ce flux de travail. |
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C'est donc pour la sélection variable de gènes que le but de cette méthode est de réduire une dimension des gènes. |
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Parce que pour l’échantillon humain, nous avons 30 000 gènes et tous ne sont pas informatifs. Nous essayons donc de sélectionner les plus informatifs. |
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méthode de dispersion et |
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méthode de transformation stabilisatrice de la variabilité basée sur la régression la plus basse. Je n'entrerai donc pas dans les détails, mais ces deux méthodes sont largement utilisées par la communauté des chercheurs et je suis plutôt content que nous ayons pu les reproduire. |
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Et nous appliquons également un SVD clairsemé pour réduire davantage les dimensions. Nous avons donc également appliqué le clustering hiérarchique et ak signifie clustering. |
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Nous effectuons un filtrage de l'importance des fonctionnalités à l'aide d'une méthode de renforcement des forêts dans JMP et si des packages R sont installés, nous faisons directement appel à la visualisation T-SNE et UMAP. |
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qui est très populaire en utilisant une analyse de séquençage d’ARN unicellulaire. Et nous avons également fourni des visualisations dynamiques, notamment un tracé de violon, un tracé de ligne de crête, un tracé de dop ; nous effectuons également l'expression différentielle des gènes. Et ainsi tous les rapports seront organisés dans un rapport très intégré au projet JMP. |
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Alors ensuite, je ferai une démo. Il y a deux objectifs dans cette démo. La première consiste à classer les populations cellulaires dans cet ensemble de données PBMC. Nous essayons de trouver quels sont les types de cellules dans cet ensemble de données. Le deuxième objectif est simplement d’identifier les jeans exprimés différemment selon les sous-types et les conditions. |
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Alors tout d’abord, passons au démarreur JMP Genomics. L'interface de JMP Genomics est donc assez différente de celle de JMP classique, mais |
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c'est assez facile à naviguer. Si vous souhaitez retrouver les bases des workflows |
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et le flux de travail de base de séquençage d'ARN unicellulaire se trouve ici, vous cliquez pour afficher cette interface. L'interface est donc assez intuitive. Je dirai que vous fournissez simplement un ensemble de données. |
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Et vous spécifiez les options QC. Quoi, quels types de gènes ou de cellules souhaitez-vous supprimer pour votre analyse et vos sélections de gènes variables. Quelle méthode souhaitez-vous utiliser, n'est-ce pas. Si vous sélectionnez un VST, vous pouvez également préciser le nombre de gènes que vous souhaitez conserver, 2000 ou 3000 |
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Et les options de clustering, à droite, combien de composants principaux vous souhaitez utiliser pour le clustering et |
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soit vous voulez une hiérarchie, soit k signifie des algorithmes de clustering. Et plus il y a d'options, plus nous avons des gènes marqueurs |
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pour vous aider à ajouter une liste de gènes marqueurs que vous souhaitez utiliser pour identifier les populations cellulaires, ce qui est un outil très pratique ici. Et vous pouvez lancer l'analyse ANOVA et l'expression différentielle. Il s’agit donc d’un rapport distinct. |
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Je n’en discuterai pas dans cette conférence. Donc, une autre chose que nous avions est un exemple d’expérience, n’est-ce pas. Si vous ajoutez cela, vous pouvez essentiellement fournir toute information relative au démarrage de la conception, comme des informations sur le traitement, |
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informations sur le sexe. Alors ceci est |
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les données simulées ici. Je voudrais juste vous montrer comment nous allons comparer les niveaux d'expression génétique et les différentes mesures entre les groupes. |
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Et enfin, nous avons des options d'intégration qui peuvent faire appel aux packages t-SNE ou UMAP R si vous les avez installés. Vous pouvez modifier différents paramètres pour cela dans nos algorithmes. |
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Ainsi, après avoir spécifié toutes ces options, lancez-vous et vous obtenez le rapport qui ressemble à celui-ci. C'est donc un |
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rapport tabulaire. Il y a un total de sept onglets dans ce rapport. Je les ai organisés dans l'ordre que vous souhaitez |
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combien de gènes dans |
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dans les cellules, combien de lectures comptent ou quel est le pourcentage de gènes mitochondriaux comptés dans vos données et les corrélations entre ces trois mesures. |
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Et nous, vous remarquez ce côté gauche, nous avons la boîte d'action. Vous pouvez l'étendre et y trouver des options, dans cette boîte, vous pouvez faire beaucoup de choses avec. |
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Dans cet onglet, en particulier, vous pouvez diviser le graphique en fonction des conditions que vous avez fournies dans le fichier de conception expérimentale. Par exemple, on peut faire un soin et on se partage |
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Médicament1, Médicament2, placebo. Ensuite, vous pouvez voir s'il y a une différence entre les différents groupes, n'est-ce pas, et nous pouvons annuler la séparation si vous souhaitez revenir à notre intrigue d'origine. |
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Et le deuxième onglet est la sélection variable des gènes, qui constitue l’épine dorsale de ce flux de travail. Les points rouges signifient les gènes que j'ai sélectionnés pour une analyse ultérieure et ceux-ci |
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les points gris sont les gènes qui seront ignorés lors de l'analyse. Et si vous développez la case d'action, vous voyez que, puisque nous utilisons le VST, nous avons spécifié 2000 gènes |
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dans cette analyse. Mais si vous changez d'avis, vous pouvez, vous pouvez, chaque fois que vous changez d'avis, vous pouvez saisir un nombre différent de gènes, puis cliquer sur OK. Ainsi, tous les onglets seront actualisés en fonction de ce nouveau numéro. |
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Ainsi, une fois que vous avez une liste de gènes variables, vous allez réduire davantage les dimensions en effectuant une analyse SVD clairsemée, ce qui équivaut à une analyse en composantes principales. |
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Ainsi, après avoir appliqué l’analyse SVD, vous pouvez tracer les deux principaux SVD ou composants principaux. Essayez de vérifier la structure globale de votre ensemble de données. |
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Donc, dans ce cas, nous pouvons voir qu’il y a deux grands groupes dans cet ensemble de données, ce qui est intéressant. Et nous fournissons également un tracé 3D pour vous aider à explorer davantage |
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vos données. Parfois, il y a des idées que vous ne pouvez pas, que vous ne pouvez pas identifier dans un tracé 2D ; Les tracés 3D peuvent parfois réellement apporter une valeur supplémentaire. |
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Et nous avons ces SVD, selon le nombre que vous avez sélectionné (20 ou 30), vous pouvez les utiliser pour |
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effectuer un regroupement. Dans ce cas, nous avons sélectionné le clustering hiérarchique et nous trouvons neuf clusters dans votre ensemble de données. |
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En plus du dendogramme, nous proposons également un tracé de constellation |
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ce que j'aime beaucoup car cette intrigue est similaire à t-SNE ou UMAP. Cela vous donne une meilleure idée de la distance entre les différents groupes, n’est-ce pas. |
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Par exemple, il y a trois groupes, des grands groupes, trois clusters |
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Un peu distinct des autres groupes. Et si vous voulez voir où ils se trouvent ici dans la structure globale, voici les trois principaux clusters que je détecte. Regardez les tracés 3D, nous pouvons voir |
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tous ceux surlignés sont ici. Et puis revenez à la 2D, c'est l'un des deux grands clusters, vous savez, que j'ai dit avoir mis en évidence, donc son interactivité vous aide vraiment à |
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observez et visualisez vos données de plusieurs manières. Et nous fournissons également un graphique parallèle pour vous aider à mieux identifier les différents modèles au sein des différents groupes. |
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Et l'onglet suivant concerne l'intégration, ce qui signifie les pièces t-SNE et UMAP si vous avez installé un packaging R. Je vais |
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appelez R, exécutez l'analyse, ramenez les données et visualisez-les dans JMP. Voici donc un tracé t-SNE. Nous avons neuf clusters très bien séparés. |
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En bas se trouve exactement la même parcelle mais cette fois je les ai colorées avec les gènes marqueurs que vous avez fournis ; nous avons 14 gènes marqueurs. Vous pouvez donc, grâce à cette fonctionnalité, passer au clic |
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pour voir où ces gènes sont exprimés, n'est-ce pas. Par exemple, il y a un gène GNLY, fortement exprimé dans ce petit cluster et nous nous demandons quelles sont nos données ? Nous sélectionnons et revenons en arrière et maintenant nous voyons tous, la plupart d'entre eux appartiennent au cluster neuf, au cluster huit. |
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GNLY est donc un gène pour les cellules NK. Il s'agit d'un gène marqueur des cellules NK. Alors maintenant, nous avons une idée de ce qu’est un groupe de cette cellule, n’est-ce pas. |
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Et nous avons également des boutons d'action ici, qui vous aident à faire plus de choses. Si vous souhaitez passer à UMAP, si vous préférez cela, vous pouvez le faire. Maintenant, les parcelles s'associent à UMAP. |
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Exactement la même chose, mais UMAP vous offre une séparation un peu meilleure, un peu meilleure et peut préserver une structure plus globale dans la visualisation. Et nous pouvons également vous fournir des moyens pour vous aider à éliminer les cellules qui pourraient être |
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contaminé ou avoir des problèmes de qualité. Par exemple, nous n'aimons pas un groupe de cellules ici, nous pouvons les supprimer de la visualisation. Rendez-le plus propre, mais vous pouvez toujours les rapporter. |
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Et encore une fois, nous pouvons diviser les tracés, ce qui est un bouton de fractionnement du graphique. Cette fois, nous pouvons diviser par sexe, nous diviser par femme, par homme. C’est vrai, nous pouvons comparer le niveau d’expression des gènes selon les groupes de genre, ce qui est parfois très utile. |
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Et nous sommes divisés. |
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Et l'onglet suivant vous fournit davantage d'outils de visualisation pour visualiser les niveaux d'expression des gènes dans les neuf |
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groupes, neuf cellules de groupe, à droite. La première partie s’appelle donc une intrigue au violon. Encore une fois, nous avons un sélecteur de fonctionnalités qui vous aide à passer à travers |
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tous ces gènes dans différents clusters, n'est-ce pas. Vous pouvez maintenant voir, selon la hauteur, la hauteur de la partie du graphique et sa densité. |
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Vous pouvez clairement voir où ces gènes sont fortement exprimés. Par exemple, encore une fois, nous donnons l'exemple où j'utilise ce gène, GNLY, vous pouvez voir qu'il est fortement exprimé dans le groupe huit. |
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Et au milieu, la deuxième parcelle que nous vous proposons est la parcelle en ligne de crête. Une parcelle de crête organise le |
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clusters sur l’axe Y et le niveau d’expression des gènes sur l’axe X. Mais cela vous offre essentiellement une chose similaire en fonction de ce que vous aimez. |
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Par exemple, GNLY, encore une fois, nous pouvons voir que le cluster huit a GNLY fortement exprimé par un nœud ou d'autres clusters. |
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Et en bas, nous avons un autre tracé appelé dot plot. C'est la nouvelle intrigue que nous venons d'ajouter à ce rapport. En plus de vous montrer les niveaux d'expression des gènes, le dot plot peut également vous montrer le pourcentage de cellules exprimant ce gène. Par exemple, jetez un œil à cet endroit, |
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Gène PPBP. Et nous pouvons voir ce groupe, dans le groupe sept que nous avons eu, nous pouvons voir 100 % des cellules du groupe sept exprimant ce gène PPBP. Ce gène est donc le gène marqueur de |
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En fait, ce sont des cellules PPBP. Alors maintenant, il est très clair que le groupe sept est un type de cellule sanguine, qui est une cellule PPBP, et ils en examinent d'autres, comme par exemple le groupe deux. |
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Seulement 12 % des cellules expriment ce gène. Il pourrait donc y avoir une certaine contamination, mais ce groupe de cellules n’est certainement pas des cellules PPBP. Donc cette intrigue vient juste de vous montrer |
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le niveau d'expression et le pourcentage d'expression dans chaque cluster qui offrent des informations supplémentaires dans le tracé. |
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L’onglet suivant est donc également très utile. C'est ce qu'on appelle le filtrage des fonctionnalités. Ce que j'ai fait, c'est un algorithme de forêt d'amplification de la décoloration, puis j'ai utilisé ces gènes pour prédire les clusters. Ainsi les gènes les plus importants ayant contribué à la séparation des cellules sont classés dans ce tableau. |
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Et la bonne façon de visualiser ces gènes est d’ouvrir cette boîte d’action. Vous sélectionnez ce top, peut-être les 35 principaux gènes que vous souhaitez visualiser. Vous cliquez sur OK. |
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L'onglet suivant ne vous montrera donc que 35 gènes que vous avez sélectionnés. Voilà donc les gènes, pour la plupart informatifs. Droite. Eux, ils peuvent expliquer |
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pourquoi ces différents groupes de cellules sont séparés. Encore une fois, nous changeons simplement ou vous pouvez cliquer et essayer de voir les modèles. Et puis si vous remarquez, il y a beaucoup de gènes LYZ, |
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CST3 et NKG7. Ceux-ci sont déjà dans les gènes marqueurs ou ont été fournis, ce qui signifie que cette fonctionnalité est sélectionnée |
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La méthode est vraiment efficace pour détecter les gènes les plus importants dans votre ensemble de données. Et une autre chose, vous pouvez faire de la visualisation via la base de données GTEx. Le GTEx est une base de données spécifique aux tissus. |
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Dites-vous quels gènes sont exprimés dans quels tissus de votre corps humain. Nous pouvons donc envoyer directement la liste des gènes à la base de données. Vous cliquez simplement sur OK. Nous ouvrirons le |
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Le site Web et le site Web GTEx vous fourniront une carte thermique, c'est vrai, donc avec les 35 principaux gènes. Maintenant, vous pouvez voir où j'ai exprimé dans ces deux tissus humains, organes, ce qui est très pratique pour voir des informations supplémentaires. |
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Maintenant que nous avons utilisé ces gènes marqueurs, vous pouvez probablement identifier de quel groupe de cellules il s'agit, n'est-ce pas. Il y en a donc un |
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la fonction ici est appelée un recode. Ce qu'il fait, c'est que vous l'ouvrez, vous pouvez maintenant recoder ces nombres en noms de cellules réels, n'est-ce pas. Par exemple, huit, nous savons déjà que c'est NK, ce sont des cellules NK. Et nous pouvons le faire... J'ai déjà des noms pour chacun d'entre eux. Alors je tape juste |
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Ceux |
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Monocite. |
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En fait, deux sont des cellules DC ; trois est le monocite FCGR3A+. |
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Ce sont des lymphocytes T CD+ naïfs. |
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Regroupez cinq cellules T mémoire CD4+. |
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Et CD8+T |
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Guan Meijian |
| Guan Meijian |
pour le groupe six ; le septième est le PPBP, comme nous l'avons déjà vu, et le neuvième est celui des cellules B. |
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Donc, avec ces recodes, nous cliquons sur recoder. Maintenant que tous les tracés et les onglets sont connectés, vous pouvez désormais constater que tous les nombres ont été transformés en noms de cellules réels. Il s'agit donc simplement de vous aider à explorer vos données dans |
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facilement, c'est vrai. Vous pouvez savoir où se trouvent ces cellules et vous pouvez à nouveau faire de l'exploration sur et dans vos parcelles. Et encore une fois, en incluant ces tracés de clustering, vous savez, vous voyez que le nom personnalisé a été remplacé par les noms de cellules réels. Euh, alors |
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C'est tout pour le sujet d'aujourd'hui. Et si vous avez des questions, vous pouvez m'envoyer un email ou laisser un message sur la Communauté JMP. Merci beaucoup pour votre temps. |
