Altoparlante
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Trascrizione
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| Meijian Guan |
Va bene. Uhm, ciao a tutti. Grazie mille per aver partecipato a questa presentazione. Sono così felice di avere l'opportunità di condividere il lavoro che ho |
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hanno fatto con il gruppo JMP Life Science e SAS Institute. Quindi l'argomento di oggi sarà la creazione di un flusso di lavoro per il sequenziamento dell'RNA di una singola cellula con il progetto JMP. Questa è una nuova funzionalità che ho sviluppato per JMP Genomics 10. Se non sai cos'è JMP Genomics, ti darò una breve descrizione |
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una panoramica su di esso e sul progetto JMP è una nuova funzionalità, rilasciata il 14 ed è uno strumento molto utile che può aiutarti a organizzare i tuoi report. Quindi abbiamo approfittato di questa nuova piattaforma e abbiamo organizzato un sequenziamento dell'RNA a singola cellula |
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flusso di lavoro al suo interno. Quindi, prima di tutto, voglio darvi un po' di informazioni su JMP, JMP Genomics |
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uno dei prodotti della famiglia JMP è basato su SAS e JMP Pro. Quindi sfruttare entrambi i prodotti costituisce uno strumento analitico molto potente. |
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Quindi è progettato per i dati genomici, quindi può leggere diversi tipi di dati genomici, può eseguire la preelaborazione, può gestire il sequenziamento di prossima generazione di quell'analisi. |
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È davvero efficace nell'espressione genetica differenziale e nella scoperta di biomarcatori e molti scienziati lo utilizzano per l'allevamento di colture e bestiame. Quindi è uno strumento molto potente. Incoraggio tutti a verificarlo se stai facendo qualcosa relativo alla genomica. |
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E la prossima cosa che voglio condividere con voi è il sequenziamento dell'RNA di una singola cellula. Molti di voi potrebbero non avere molta familiarità con esso. |
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Quindi questa è una tecnologia relativamente nuova utilizzata per esaminarlo a livello di singole cellule. |
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E rispetto alla tradizionale tecnologia di sequenziamento dell'RNA che rileva il livello di espressione medio di un gruppo di cellule. |
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Questa nuova tecnologia fornisce una maggiore risoluzione delle differenze cellulari e offre una migliore comprensione della funzione della singola cellula nel contesto del suo microambiente. |
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E può aiutare a fare molte cose come scoprire popolazioni cellulari nuove e rare, tracciare le traiettorie di sviluppo cellulare e identificare geni espressi in modo differenziale tra tipi di cellule. Quindi ha un'applicazione molto ampia. |
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Un'applicazione recente è che gli scienziati lo utilizzano per combattere il Covid 19, quindi perché può essere utilizzato |
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caratterizzazione dei cambiamenti trascrizionali nelle cellule immunitarie e come sviluppare vaccini e trattamenti. Inoltre, è ampiamente utilizzato nella ricerca sul cancro e ampiamente utilizzato in immunologia e in molti altri campi di ricerca. Ehm, quindi è uno strumento molto potente, ma |
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analizzare tali dati presenta alcune sfide, ecco perché abbiamo messo insieme questo flusso di lavoro. |
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Volevo solo darti una panoramica della linea superiore del sequenziamento dell'RNA a cellula singola. Quindi la prima cosa di cui hai bisogno è prendere un campione, |
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né da esseri umani né da animali. Potrebbe essere un tumore o un campione di laboratorio. E poi puoi isolare quei campioni in singole cellule. |
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Quindi, dopo aver isolato, puoi eseguire il sequenziamento su ogni singola cellula per tutti i geni che hai. Ad esempio, negli esseri umani abbiamo circa 30.000 geni. Quindi il prodotto finale apparirà così nella nostra tabella di conteggio delle letture. Abbiamo geni... 30.000 geni in fila e li abbiamo |
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a volte circa mezzo milione di celle come colonne. Quindi, come puoi vedere, soddisfare questi set di dati molto grandi ha dimensioni molto elevate. Inoltre puoi notare gli zeri nella tabella perché |
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A causa delle limitazioni tecniche o biologiche, non è possibile rilevare ogni singolo gene in ogni singola cellula. Quindi non è raro vedere che il 90% delle cellule lo sono effettivamente |
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zeri. Quindi è molto scarso. La scarsità è un'altra sfida quando si analizzano i dati di sequenziamento dell'RNA di singole cellule. |
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Ma dopo aver eseguito la preelaborazione, la pulizia e la riduzione delle dimensioni, è possibile applicare analisi regolari, come il clustering e i componenti principali, dell'espressione genetica differenziale su questi dati. Quindi quelli saranno menzionati nel mio flusso di lavoro. |
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E ne ho già parlato in modo che ho notato sfide, tra cui alta dimensionalità, alta scarsità e anche una diversa eterogeneità tra le popolazioni cellulari. |
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Rumori tecnici e riproducibilità, poiché esistono così tanti protocolli di sequenziamento diversi e così tanti pacchetti analitici diversi. |
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In R, Python o altri strumenti, è molto difficile per te seguire i passaggi esatti per analizzare i tuoi dati. E se hai confuso i passaggi e non hai fatto le cose nell'ordine corretto, |
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potresti non essere in grado di ottenere risultati riproducibili. Questo è uno dei problemi che abbiamo cercato di risolvere qui. |
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Voglio solo mostrarti un esempio di dati di sequenziamento dell'RNA di una singola cellula. Questi dati verranno utilizzati nella mia dimostrazione e si tratta di dati ridotti su un campione di sangue o ppm. Vedi, ho detto che abbiamo le cellule in righe e i geni in colonne, quindi è così |
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circa 8000 colonne e 100 |
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righe, che significherebbero celle. E puoi vedere quegli zeri praticamente ovunque. Credo che ci sia più del 90% di scarsità in questo specifico set di dati. |
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Allora, cosa c'è nel nostro nuovo flusso di lavoro di sequenziamento dell'RNA a cellula singola in JMP Genomics 10? Quindi, per questo flusso di lavoro, abbiamo provato a costruirlo |
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per quelle persone che non hanno un ottimo background tecnico o meno, non hanno tempo per imparare a programmare e tutte quelle statistiche. Quindi in questo flusso di lavoro inseriamo questi passaggi nell'ordine giusto affinché gli utenti possano eseguire automaticamente gli altri passaggi nel flusso di lavoro. E anche noi |
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fornire report molto interattivi per aiutare gli utenti a navigare con noi e modificare i parametri e controllare le diverse selezioni. |
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Quindi cosa c'è in questo flusso di lavoro, incluso l'avanzamento dell'importazione dei dati, la preelaborazione e abbiamo un metodo di selezione dei geni variabile, che in realtà è la spina dorsale di questo flusso di lavoro. |
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Quindi è per la selezione genetica variabile che l'obiettivo di questo metodo è ridurre una dimensione dei geni. |
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Perché nel campione umano abbiamo 30.000 geni e non tutti sono informativi. Quindi proviamo a scegliere quelli più informativi. |
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metodo di dispersione e |
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metodo di trasformazione di stabilizzazione della variabilità basato sulla regressione più bassa. Quindi non entrerò nei dettagli, ma questi due metodi sono ampiamente utilizzati nella comunità di ricerca e sono abbastanza felice che siamo riusciti a riprodurli. |
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E applichiamo anche SVD sparsi per ridurre ulteriormente le dimensioni. E quindi abbiamo applicato anche il clustering gerarchico e ak significa clustering. |
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Effettuiamo uno screening dell'importanza delle funzionalità utilizzando un metodo di potenziamento della foresta in JMP e se sono installati pacchetti R, ci rivolgiamo direttamente alla visualizzazione T-SNE e UMAP |
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che è molto popolare utilizzando un'analisi di sequenziamento dell'RNA a singola cellula. E abbiamo anche fornito alcune visualizzazioni dinamiche tra cui la trama del violino, la trama della ridgeline, la trama della dop; facciamo anche l'espressione genica differenziale. E così tutti i report saranno organizzati in report molto integrati con il progetto JMP. |
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Quindi la prossima volta farò una demo. Ci sono due obiettivi in questa demo. Il primo è classificare le popolazioni cellulari in questo set di dati PBMC. Cerchiamo di scoprire quali sono i tipi di celle in questo set di dati. Il secondo obiettivo è semplicemente identificare i jeans espressi in modo differenziale attraverso sottotipi e condizioni. |
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Quindi, prima di tutto, passiamo al punto di partenza di JMP Genomics. Quindi l'interfaccia di JMP Genomics sembra molto diversa dal normale JMP ma |
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è abbastanza facile da navigare. Se desideri trovare le nozioni di base sui flussi di lavoro |
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e il flusso di lavoro di base del sequenziamento dell'RNA a cellula singola risiede qui, fai clic per visualizzare questa interfaccia. Quindi l'interfaccia è piuttosto intuitiva. Dirò che fornisci solo un set di dati. |
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E specifichi le opzioni QC. Cosa, quali tipi di geni o cellule vuoi rimuovere per la tua analisi e le selezioni di geni variabili. Quale metodo vuoi usare, giusto. Se selezioni un VST, puoi anche specificare il numero di geni che vuoi mantenere, 2000 o 3000 |
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E le opzioni di clustering, giusto, quanti componenti principali vuoi utilizzare per il clustering e |
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o vuoi gerarchico o k significa algoritmi di clustering. E più opzioni abbiamo, più abbiamo i geni marcatori |
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per aiutarti ad aggiungere un elenco di geni marcatori che desideri utilizzare per identificare le popolazioni cellulari, che è uno strumento molto utile qui. Ed è possibile avviare ANOVA e analisi delle espressioni differenziali. Quindi questo è un rapporto separato. |
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Non ne parlerò in questo discorso. Quindi un'altra cosa che avevamo era un esempio di esperimento, giusto. Se aggiungi che fondamentalmente puoi fornire qualsiasi informazione relativa all'avvio della progettazione come le informazioni sul trattamento, |
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informazioni sul sesso. Quindi è questo |
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i dati simulati qui. Vorrei solo mostrarti come confronteremo i livelli di espressione genetica e le diverse misurazioni tra i gruppi. |
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Infine, abbiamo opzioni di incorporamento che possono richiamare i pacchetti t-SNE o UMAP R se li hai installati. Puoi modificare diversi parametri per questo nei nostri algoritmi. |
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Quindi, dopo aver specificato tutte queste opzioni, vai su Esegui e avrai il report simile a questo. Quindi questo è un |
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rapporto tabellare. Ci sono un totale di sette schede in questo rapporto. Li ho organizzati nell'ordine che preferisci |
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quanti geni ci sono |
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nelle celle, quanti conteggi di lettura o qual è la percentuale di conteggi dei geni dei mitocondri nei tuoi dati e le correlazioni tra queste tre misurazioni. |
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E noi, noti questo lato sinistro, abbiamo la casella delle azioni. Puoi espanderlo e trovare opzioni in questo, in questa casella puoi fare molte cose con esso. |
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In questa scheda, nello specifico, puoi dividere il grafico, in base alle condizioni fornite nel file di disegno sperimentale. Ad esempio possiamo fare un trattamento e dividerci |
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Farmaco1, Farmaco2, placebo. Quindi puoi vedere se c'è qualche differenza tra i diversi gruppi, giusto, e possiamo annullare la divisione se vuoi tornare alla nostra trama originale. |
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E la seconda scheda è la selezione genetica variabile, che è la spina dorsale di questo flusso di lavoro. I punti rossi indicano quei geni che ho selezionato per le analisi successive e questi |
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i punti grigi sono i geni che verranno scartati nell'analisi. E se espandi la casella delle azioni, puoi vedere che, poiché utilizziamo il VST, abbiamo specificato 2000 geni |
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in questa analisi. Ma se cambi idea, puoi, puoi, ogni volta che cambi idea, puoi digitare un numero diverso di geni e poi fare clic su OK. Quindi tutte le schede verranno aggiornate in base a questo nuovo numero. |
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Quindi, dopo aver ottenuto un elenco di geni variabili, ciò che farai è ridurre ulteriormente le dimensioni eseguendo un'analisi SVD sparsa, che equivale all'analisi delle componenti principali. |
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Pertanto, dopo aver applicato l'analisi SVD, è possibile tracciare i primi due SVD o componenti principali. Prova a controllare la struttura globale del tuo set di dati. |
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Quindi in questo caso possiamo vedere che ci sono due grandi gruppi in questo set di dati, il che è interessante. Inoltre forniamo una trama 3D per aiutarti a esplorare ulteriormente |
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i tuoi dati. A volte ci sono alcune intuizioni che non è possibile identificare in una trama 2D; Le trame 3D a volte possono davvero fornire un valore aggiunto. |
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E abbiamo questi SVD, a seconda di quanti ne hai selezionati (20 o 30), puoi usarli per |
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eseguire il clustering. In questo caso abbiamo selezionato il clustering gerarchico e troviamo nove cluster nel tuo set di dati. |
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Oltre al dendogramma offriamo anche un grafico delle costellazioni |
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che mi piace molto perché questa trama è simile a t-SNE o UMAP. Ti dà un'idea migliore della distanza tra i diversi gruppi, giusto. |
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Ad esempio, ci sono tre gruppi, grandi gruppi, tre cluster |
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Un po' distinto dagli altri gruppi. E se vuoi vedere dove sono nella struttura globale qui, questi sono i primi tre cluster che rilevo. Guarda i grafici 3D, possiamo vedere |
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tutti quelli evidenziati sono qui. E poi vai di nuovo in 2D, questo è uno dei due grandi cluster, sai, che ho detto di aver evidenziato, quindi l'interattività ti aiuta davvero a |
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osservare e visualizzare i dati in più modi. E forniamo anche un grafico parallelo per aiutarti a identificare ulteriormente i diversi modelli tra i diversi gruppi. |
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E la scheda successiva è l'incorporamento, il che significa parti t-SNE e UMAP se è installato il pacchetto R. Lo farò |
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chiamare R, eseguire l'analisi, riportare i dati e visualizzarli in JMP. Quindi ecco un grafico t-SNE. Abbiamo nove cluster separati molto bene. |
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In basso c'è esattamente la stessa trama ma questa volta li ho colorati con i geni marcatori che hai fornito; abbiamo 14 geni marcatori. Quindi puoi, utilizzando questa funzione, passare al clic |
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per vedere dove sono espressi questi geni, giusto. Ad esempio, c'è un gene GNLY, altamente espresso in questo piccolo cluster e ci chiediamo, quali sono i nostri dati? Selezioniamo e torniamo indietro e ora vediamo tutti, la maggior parte proviene dal cluster nove, cluster otto. |
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Quindi GNLY è un gene per le cellule NK. Questo è un gene marcatore per le cellule NK. Quindi ora abbiamo un'idea di cosa sia un gruppo di questa cellula, giusto. |
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Inoltre qui abbiamo pulsanti di azione che ti aiutano a fare più cose. Se vuoi passare a UMAP, se preferisci, puoi farlo. Ora le trame si associano a UMAP. |
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Esattamente la stessa cosa, ma UMAP ti offre una separazione leggermente migliore, leggermente migliore e può preservare una struttura più globale nella visualizzazione. E possiamo anche fornire alcuni modi per aiutarti a rimuovere le cellule che potrebbero essere |
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contaminati o presentano problemi di qualità. Ad esempio, non ci piace un gruppo di celle qui, possiamo rimuoverle dalla visualizzazione. Rendilo più pulito, ma puoi sempre riportarli indietro. |
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E ancora, possiamo dividere i grafici, che è un pulsante del grafico diviso. Questa volta possiamo dividerci in base al genere, possiamo dividerci in femmine e maschi. Esatto, possiamo confrontare il livello di espressione genetica tra i gruppi di genere, il che a volte è piuttosto utile. |
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E siamo divisi. |
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E la scheda successiva fornisce ulteriori strumenti di visualizzazione per visualizzare i livelli di espressione genetica nei nove |
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gruppi, nove celle di gruppo, a destra. Quindi la prima parte si chiama trama del violino. Ancora una volta, abbiamo un commutatore di funzionalità che ti aiuta a procedere |
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tutti quei geni in gruppi diversi, giusto. Ora puoi vedere, a seconda di come, quanto è alta la parte del grafico e qual è la sua densità. |
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Puoi vedere chiaramente dove questi geni sono altamente espressi. Ad esempio, ancora una volta, diamo l'esempio in cui sto usando questo gene, GNLY, puoi vedere che è altamente espresso nel cluster otto. |
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E nel mezzo, il secondo grafico che ti forniamo è il grafico della dorsale. Una trama di cresta sta organizzando il |
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cluster sull'asse Y e il livello di espressione genica sull'asse X. Ma fondamentalmente ti fornisce una cosa simile a seconda di ciò che ti piace. |
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Ad esempio, GNLY, ancora una volta, possiamo vedere che il cluster otto ha GNLY altamente espresso da nodi o altri cluster. |
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E in basso abbiamo un altro grafico chiamato dot plot. Questa è la nuova trama che abbiamo appena aggiunto a questo rapporto. Oltre a mostrarti i livelli di espressione genetica, il diagramma a punti può anche mostrarti la percentuale di cellule che esprimono quel gene. Ad esempio, dai un'occhiata a questo posto, |
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Gene PPBP. E possiamo vedere questo cluster, nel cluster sette che abbiamo avuto, possiamo vedere il 100% delle cellule nel cluster sette che esprimono questo gene PPBP. Quindi questo gene è il gene marcatore per |
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Cellule PPBP in realtà. Quindi ora è molto chiaro che il cluster sette è un tipo di cellula del sangue, che è una cellula PPBP e danno un'occhiata ad altri, come ad esempio il cluster due. |
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C'è solo il 12% delle cellule che esprimono questo gene. Quindi potrebbe esserci qualche contaminazione ma questo gruppo di cellule non è sicuramente cellule PPBP. Quindi questa trama ti sta solo mostrando |
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il livello di espressione e la percentuale di espressione in ciascun cluster che offre informazioni aggiuntive nel grafico. |
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Quindi anche la scheda successiva è molto utile. Si chiama screening delle funzionalità. Ciò che ho fatto è stato un algoritmo di potenziamento della foresta in dissolvenza e quindi l'utilizzo di quei geni per prevedere i cluster. Quindi in questa tabella sono classificati i geni più importanti che hanno contribuito alla separazione delle cellule. |
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E il modo corretto per visualizzare questi geni è aprire questa casella di azione. Seleziona questi forse i primi 35 geni che vuoi visualizzare. Fai clic su OK. |
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Quindi la scheda successiva ti mostrerà solo 35 geni selezionati. Quindi questi sono i geni, per lo più informativi. Giusto. Loro, loro possono spiegare |
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perché questi diversi gruppi di cellule sono separati. Quindi, ancora una volta, cambiamo semplicemente oppure puoi fare clic e provare a vedere gli schemi. E poi se noti, ci sono molti geni LYZ, |
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CST3 e NKG7. Quelli sono già nei geni marcatori o sono stati forniti, il che significa che questa caratteristica viene sottoposta a screening |
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Il metodo ha davvero successo nel raccogliere i geni più importanti nel tuo set di dati. E un'altra cosa, puoi fare la visualizzazione tramite il database GTEx. Il GTEx è un database specifico dei tessuti. |
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Dirti quali geni sono espressi in quale tessuto nel tuo corpo umano. Quindi possiamo inviare direttamente l'elenco dei geni al database. Basta fare clic su OK. Apriremo il |
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Il sito web e il sito web GTEx ti forniranno una mappa termica, giusto, quindi con i 35 geni principali. Ora potete vedere dove ho espresso in quei due tessuti umani, gli organi, il che è molto comodo per vedere informazioni aggiuntive. |
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Quindi ora che abbiamo utilizzato quei geni marcatori, probabilmente potrete identificare di che gruppo di cellule si tratta, giusto. Quindi ce n'è uno |
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la funzione qui è chiamata ricodifica. Quello che fa è, lo apri, ora puoi ricodificare quei numeri nei nomi delle celle reali, giusto. Ad esempio, otto sappiamo già che è NK, sono cellule NK. E possiamo farlo... ho già i nomi per ognuno di loro. Quindi digito e basta |
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Quelli |
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Monocito. |
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Due sono in realtà le celle DC; tre sono monociti FCGR3A+. |
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Queste sono cellule T CD+ Naive. |
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Raggruppare cinque cellule T CD4+ di memoria. |
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E CD8+T |
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Meijian Guan |
| Meijian Guan |
per il gruppo sei; sette sono PPBP, come abbiamo già visto e il nono sono le cellule B. |
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Quindi con quelle ricodifica facciamo clic su ricodifica. Ora, poiché tutti i grafici e le schede sono collegati, ora puoi scoprire che tutti i numeri sono cambiati in nomi di celle effettivi. Quindi ti aiuta solo a esplorare i tuoi dati |
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facilmente, giusto. Puoi sapere dove sono quelle celle e puoi ancora fare qualche esplorazione su e nei tuoi grafici. E ancora, inclusi questi grafici di clustering, sai, vedi che il nome personalizzato è stato cambiato nei nomi effettivi delle celle. Ehm, quindi |
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Questo è tutto per l'argomento di oggi. E se hai domande, puoi inviarmi un'e-mail o lasciare un messaggio nella community JMP. Grazie mille per il tuo tempo. |
