编者注：这篇文章是由@龙克内特和@大卫_s的凯帕集团。 这是一系列帖子的一部分，称为QbD 专栏。
在我们的上一篇博文，我们写了关于使用设计实验开发分析方法。 这篇文章继续讨论分析方法，并展示一种新型的实验设计，即最终筛选设计[1] （DSD），可用于评估和改进分析方法。
我们首先快速回顾分析方法并简要总结其中描述的实验上一篇博文，然后展示通过使用 DSD 学到的内容。
什么是分析方法？
分析方法用于进行基本的产品和过程测量。 此类测量系统在制药行业至关重要，了解过程监测和控制要求对于开发合理的分析方法非常重要。 评估分析方法的典型要求包括：
- 精确：此要求确保方法变异性仅占规格范围（规格上限 - 规格下限）的一小部分。
- 选择性：这决定了在每个生产步骤中监测哪些杂质，并指定了充分区分每种杂质相对比例的设计方法。
- 灵敏度：这涉及到需要准确反映 CQA 变化的方法，这些变化相对于规格限很重要，这对于有效的过程控制至关重要。
分析方法开发中的 QbD 实施通常是一个四阶段过程，涉及方法的设计和控制[2] 。 阶段是：
- 方法设计意图：识别并指定分析方法的性能。
- 方法设计选择：选择实现设计意图的方法工况。
- 方法控制定义：针对对性能变化影响最大的组件建立并定义适当的控制措施。
- 方法控制验证：通过稳健有效的控制展示可接受的方法性能。
我们在这里继续讨论如何使用统计设计的实验来实现鲁棒性，这是我们在上一篇博客文章中开始的。
HPLC 开发案例研究
我们在上一篇文章中介绍的案例研究涉及高效液相色谱 (HPLC) 方法的开发[3] 。 该特定系统由配备可变波长 UV 检测器的 Agilent 1050 和 3396-A 型积分器组成。 表 1 列出了本案例研究设计的实验中使用的因素及其水平。 最初的实验阵列是 2 7-4具有三个中心点的分数阶乘实验（参见表 2）。 级别“-1”和“1”对应于表1中列出的下限和上限，“0”对应于标称级别。 选择较低和较高水平以反映正常操作期间标称设置可能自然发生的变化。
Table 1. Factors and levels in HPLC experiments.Table 1. Factors and levels in HPLC experiments.Table 1. Factors and levels in HPLC experiments.Table 1. Factors and levels in HPLC experiments.Table 1. Factors and levels in HPLC experiments.Table 1. Factors and levels in HPLC experiments.Table 1. Factors and levels in HPLC experiments.Table 1. Factors and levels in HPLC experiments.表格1。 HPLC 实验中的因素和水平。 
Table 2. Original Fractional Factorial experimental array for HPLC experiment.Table 2. Original Fractional Factorial experimental array for HPLC experiment.Table 2. Original Fractional Factorial experimental array for HPLC experiment.Table 2. Original Fractional Factorial experimental array for HPLC experiment.Table 2. Original Fractional Factorial experimental array for HPLC experiment.Table 2. Original Fractional Factorial experimental array for HPLC experiment.Table 2. Original Fractional Factorial experimental array for HPLC experiment.Table 2. Original Fractional Factorial experimental array for HPLC experiment.表 2. 用于 HPLC 实验的原始分数阶乘实验阵列。
部分因子实验（表 2）由 11 次运行组成，这些运行将设计因子水平组合成一组平衡的组合，包括三个中心点。
我们从部分析因实验中学到了什么？
在我们的上一篇文章，我们分析了析因实验的数据，发现该实验回答了几个重要问题：
- 该方法对输入设置的自然变化有多敏感？
- 哪些输入对该方法的输出影响最大？
- 是否有不同的输入决定不同反应的敏感性？
- 相对于自然的运行间变异，因子变异传递的变异是否较大？
上述所有答案都与我们在因子处于名义设置时评估因子变异影响的能力有关。 然而，它们并没有解决通过可能将标称设置移至对因子变化不太敏感的设置来提高鲁棒性的可能性。
鲁棒性和非线性
鲁棒性与非线性密切相关。 我们在上一篇博客文章中看到了这个功能。析因实验的初步分析显示出明显的不拟合，该团队将其归因于“梯度”因素。我们使用具有梯度二次项的模型，发现将标称值置于结果曲线的“谷”附近可以有效减少传输的变化量。 因此，添加的二次项提供了有关在何处设置梯度以实现稳健方法的宝贵信息。
相互作用的存在是非线性的另一种形式，会对方法的稳健性产生影响。 当其中一个因素的影响斜率取决于另一个因素的设置时，两个因素会对响应产生交互作用。 在稳健性实验中，斜率直接反映方法的灵敏度。 因此，当存在交互作用时，我们通常可以将其中一个因素的标称水平设置为缓和第二个因素斜率的水平，从而减少其对传递变异的贡献。 以这种方式利用相互作用是 Genichi Taguchi 质量工程实验的基本工具[4] 。
我们如何规划实验以提高稳健性？
我们在上一篇文章中分析的部分因子实验对于估计因子的线性效应是有效的——这足以评估稳健性。然而，为了提高鲁棒性，我们需要一个足够大的设计来让我们估计线性和非线性效应。自然的第一步是考虑估计“二阶效应”，其中包括纯二次效应，例如我们之前的文章中的梯度和双因素相互作用。
我们可以通过三种方式考虑扩大实验来估计分析方法性能模型中的附加项。 具体来说，我们可以使用适合估计的设计：
- 所有双因素相互作用和纯二次效应。
- 所有双因素相互作用，但没有纯二次方程。
- 所有纯二次方程但没有相互作用。
选项 1 存在有效的设计，例如中心复合材料和 Box-Behnken 设计。类似地，可以通过两水平部分因子设计（选项 2）来估计二因素交互作用。 这两种选择的主要缺点是它们需要太多的实验运行。 实验中的K个因子，有K个主效应、K个纯二次项和K(K-1)/2个双因子交互作用。 我们还需要估计总体均值，因此我们至少需要 1+K(K+1)/2 次运行来估计所有主效应和二因素交互作用。 如果 K 很小，这可能是完全可行的。 然而，当 K=7 时，如在 HPLC 实验中，总共至少需要 29 次运行（并且至少需要 36 次才能估计纯二次方程）。 这些实验的规模约为上一篇博客文章中分析的部分因子设计的三倍，并且实施起来成本太高。
这里我们考虑选项 3，设计估计所有纯二次方程，但没有交互作用。 为此目的，一类非常有用的实验设计是最终筛选设计（DSD）。 我们将在下一节中展示如何使用 DSD 来研究和提高分析方法的稳健性。
应用最终筛选设计
如果 K 为偶数，则 K 因子的最终筛选设计 (DSD) 需要 2K+1 次运行，如果 K 为奇数，则需要 2K+3 次运行（以确保主效应正交性）。 该设计需要估计 2K+1 个回归项，因此这等于或接近所需的最小运行次数。 在这样的设计中，所有因素都在阶乘排列中的三个水平上运行，主效应是正交的并且没有混叠（部分或全部），具有二次效应和双因素相互作用效应，并且没有完全二次或双向相互作用效应。与另一个二次或双向交互作用混叠。 通过 DSD，我们可以估计所有线性和二次主效应。此外，如果某些因素被证明具有可以忽略不计的影响，我们也许能够估计一些双因素相互作用。 HPLC 研究有七个因素，因此 DSD 需要 17 次实验运行（参见表 3）。 对于稳健性研究，估计运行间变异的大小非常重要。 此应用中的 DSD 有两个误差自由度，因此不需要额外运行。 如果 K 为偶数，建议添加至少两次运行以允许估计误差。 实现此目的的一个简单方法是在设计中添加更多中心点。
Table 3: Definitive Screening Design with seven factorsTable 3: Definitive Screening Design with seven factorsTable 3: Definitive Screening Design with seven factorsTable 3: Definitive Screening Design with seven factorsTable 3: Definitive Screening Design with seven factorsTable 3: Definitive Screening Design with seven factorsTable 3: Definitive Screening Design with seven factorsTable 3: Definitive Screening Design with seven factors表 3：包含七个因素的最终筛选设计
通过分析 DSD 实验数据我们能学到什么？
与上一篇博文一样，我们将通过查看 HPLC 应用中的 PeakHeight 响应结果来说明分析。 在整个过程中，为了便于演示，我们将实际的 PeakHeights 除以 1000。 我们继续对 DSD 实验数据拟合一个模型，其中包括所有主效应和纯二次效应。 分析表明，唯一显着的二次效应是梯度效应。除了梯度二次效应之外，我们决定在模型中保留线性主效应：梯度、柱温、检测波长和三乙胺百分比。 在图 1 中，我们显示了将该简化模型拟合到 PeakHeight 响应的参数估计值。 所有项均具有统计显着性，调整后的 R 2为 87%，运行间变异的估计标准差为 2.585。
Figure 1. Parameter estimates of peakHeight with quadratic model.Figure 1. Parameter estimates of peakHeight with quadratic model.Figure 1. Parameter estimates of peakHeight with quadratic model.Figure 1. Parameter estimates of peakHeight with quadratic model.Figure 1. Parameter estimates of peakHeight with quadratic model.Figure 1. Parameter estimates of peakHeight with quadratic model.Figure 1. Parameter estimates of peakHeight with quadratic model.Figure 1. Parameter estimates of peakHeight with quadratic model.图1。 使用二次模型对peakHeight 进行参数估计。我们在下面的图 2 中展示了简化二次模型的探查器。
Figure 2. Profiler of HPLC experiments with reduced quadratic model derived from DSD experiments.Figure 2. Profiler of HPLC experiments with reduced quadratic model derived from DSD experiments.Figure 2. Profiler of HPLC experiments with reduced quadratic model derived from DSD experiments.Figure 2. Profiler of HPLC experiments with reduced quadratic model derived from DSD experiments.Figure 2. Profiler of HPLC experiments with reduced quadratic model derived from DSD experiments.Figure 2. Profiler of HPLC experiments with reduced quadratic model derived from DSD experiments.Figure 2. Profiler of HPLC experiments with reduced quadratic model derived from DSD experiments.Figure 2. Profiler of HPLC experiments with reduced quadratic model derived from DSD experiments.图 2. HPLC 实验的分析器，具有源自 DSD 实验的简化二次模型。
寻找稳健的解决方案
为了提高鲁棒性，我们需要识别非线性效应。 这里唯一的非线性效应是梯度。 图 2 向我们展示了梯度的二次响应曲线达到了非常接近标称值（图 2 的编码单位中的 0）的最小值。 因此，将梯度的名义水平设置为该水平对于鲁棒性来说是一个不错的选择。 其他因素也可以保持其标称设置。 它们仅具有较小的二次效应，因此将它们移至其他设置不会对方法的稳健性产生影响。
正如上一篇文章中一样，我们可以通过将正态分布分配给输入因子来评估变异水平。正如在那篇文章中一样，我们使用 JMP 中的默认选项，该选项为每个输入分配标准差为 0.4 的正态分布（以编码单位表示）。 图 3 显示了该模拟的结果。 与因子水平变化相关的 PeakHeight 标准差为 2.697，其大小与实验数据的运行间变化的 SD 非常相似。 总体方法 SD 的估计值为 3.736（2.697 的平方根） 2 + 2.585 2 ）。
Figure 3. Profiler of peakHeight at nominal levels with added noise.Figure 3. Profiler of peakHeight at nominal levels with added noise.Figure 3. Profiler of peakHeight at nominal levels with added noise.Figure 3. Profiler of peakHeight at nominal levels with added noise.Figure 3. Profiler of peakHeight at nominal levels with added noise.Figure 3. Profiler of peakHeight at nominal levels with added noise.Figure 3. Profiler of peakHeight at nominal levels with added noise.Figure 3. Profiler of peakHeight at nominal levels with added noise.图 3. 标称水平下的 PeakHeight 分析器，增加了噪声。
将 DSD 分析结果与分数阶乘分析结果进行比较是有启发性的。上一篇博文。 两个实验都得出这样的结论：梯度对 PeakHeight 具有非线性影响，并且将梯度设置为接近其计划的标称水平对于分析方法的鲁棒性来说是一个不错的选择。 分数阶乘无法将梯度识别为有趣的因子；这是实验团队经过充分讨论后才发生的。 即便如此，人们仍然担心将所有非线性归因于梯度的决定可能完全不正确。 另一方面，DSD 只需再运行几次，就能够支持一个明确的结论：梯度是唯一具有非线性效应的因素。 无需辩论和假设；这个问题可以从实验数据来确定。
DSD 和分数阶乘都能够评估因素不确定性的方差，并且都认为贡献最重要的三个因素是梯度、柱温和检测波长。 DSD 确定了第四个因素，即三乙胺的百分比，发挥着重要作用。
DSD 通过估计所有纯二次效应，还能够充分确认将任何因子转移到不同的标称值不会直接提高方法的稳健性。 由于两个因素的相互作用，改进仍然是可能的；但正如我们所指出的，只有更大的实验才能检测到这些相互作用。
我们还能提高方法的稳健性吗？
DSD 向我们表明，改变名义水平并不是解决问题的办法。 另一种方法是对工艺参数进行更严格的控制，从而限制它们的自然变化。 此外，DSD 帮助我们优先选择要控制的因素。图 1 和图 3 表明最强的线性效应是由柱温引起的。 他们还表明，梯度的强烈非线性效应可能导致了一些最高的peakHeight值。 因此，这两个变量似乎是增强控制的主要候选者。图 4 和图 5 使用带有分析器的模拟器选项来查看将每个因素的自然传播依次减少 2 倍的效果。 随着柱温控制的加强，与因子不确定性相关的 SD 从 2.697 下降至 2.550。 减少梯度的变化会带来更实质性的改进。 SD 下降约 40%，至 1.667。
Figure 4. Profiler of peakHeight at nominal levels with added noise and enhanced control of the column temperature.Figure 4. Profiler of peakHeight at nominal levels with added noise and enhanced control of the column temperature.Figure 4. Profiler of peakHeight at nominal levels with added noise and enhanced control of the column temperature.Figure 4. Profiler of peakHeight at nominal levels with added noise and enhanced control of the column temperature.Figure 4. Profiler of peakHeight at nominal levels with added noise and enhanced control of the column temperature.Figure 4. Profiler of peakHeight at nominal levels with added noise and enhanced control of the column temperature.Figure 4. Profiler of peakHeight at nominal levels with added noise and enhanced control of the column temperature.Figure 4. Profiler of peakHeight at nominal levels with added noise and enhanced control of the column temperature.图 4. 标称水平下的 PeakHeight 分析器，增加了噪音并增强了对柱温的控制。
Figure 5. Profiler of peakHeight at nominal levels with added noise and enhanced control of the gradient.Figure 5. Profiler of peakHeight at nominal levels with added noise and enhanced control of the gradient.Figure 5. Profiler of peakHeight at nominal levels with added noise and enhanced control of the gradient.Figure 5. Profiler of peakHeight at nominal levels with added noise and enhanced control of the gradient.Figure 5. Profiler of peakHeight at nominal levels with added noise and enhanced control of the gradient.Figure 5. Profiler of peakHeight at nominal levels with added noise and enhanced control of the gradient.Figure 5. Profiler of peakHeight at nominal levels with added noise and enhanced control of the gradient.Figure 5. Profiler of peakHeight at nominal levels with added noise and enhanced control of the gradient.图 5. 标称水平上的 PeakHeight 分析器，增加了噪声并增强了梯度控制。
概括
稳健性实验是分析方法发展的重要阶段。 这些实验有意改变无法完美控制其标称值的工艺因素。 用于拟合线性回归模型的实验对于评估稳健性很有用，但对于提高稳健性的价值有限。
我们在这里展示了如何利用非线性效应来实现更稳健的分析方法。确定性筛选设计对于此类实验特别有用。 为了最小的实验成本，它提供了足够的数据来估计每个输入因子的曲率。 当存在曲率时，我们已经了解了如何利用它来提高鲁棒性。 当曲率被利用时，我们已经看到如何使用实验结果通过更严格地控制一个或多个输入因素来实现进一步的改进。
笔记
[1] Jones, B. 和 Nachtsheim, CJ (2011)“存在二阶效应时进行明确筛选的一类三水平设计”质量技术杂志, 43 。 1-15。
[2]博尔曼，P.， 内瑟科特，P.， 查特菲尔德，M.， 汤普森，D.， Truman, K. (2007)，制药技术。 http://pharmtech.findpharma.com/pharmtech/Peer-Reviewed+Research/The-Application-of-Quality-by-Design-to-Analytical/ArticleStandard/Article/detail/463580
[3]罗梅罗河， 加斯奎兹，D.， 桑谢斯，M.， Rodriguez, L. 和 Bagur, M. (2002)，分析 HPLC 稳健性测试的几何方法，LCGC 北美， 20 ，第 72-80 页， www.chromatographyonline.com 。
[4]斯坦伯格，DM， 布尔斯廷，D. (1994)。 具有噪声因素的稳健设计实验中的色散效应，质量技术杂志、26、12-20。
