El cáncer gástrico es una causa común de muerte por cáncer y su tasa de incidencia sigue siendo alta en mi país, lo que amenaza gravemente la salud de las personas (Zheng Ying y Wu Chunxiao, 2016). Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) están estrechamente relacionadas con el pronóstico de supervivencia del cáncer gástrico (Tsai et al., 2013), las PBMC tienen función inmune (Lv Qiuju et al., 2015) y tienen un importante valor de investigación clínica y biológica (Kim et al., 2016), ampliamente utilizado en la investigación del tratamiento de tumores (Koeck et al., 2016). Sin embargo, no existe consenso sobre las condiciones para aislar PBMC de sangre venosa periférica (Moreli et al., 2016; Corkum et al., 2015; Dai Guangming et al., 2014), que necesita urgentemente una investigación en profundidad.
El diseño experimental basado en el software JMP puede obtener resultados confiables con un menor número de experimentos bajo la premisa de controlar eficazmente los errores (Wu Fan et al., 2016). Este estudio utiliza el software JMP para personalizar las condiciones de separación de PBMC y optimizar el tiempo y la velocidad de centrifugación, proporcionando una base para la optimización, la investigación básica y clínica de la separación de PBMC en pacientes con cáncer gástrico.
Materiales y métodos
La sangre venosa utilizada en este experimento se extrajo de pacientes con cáncer gástrico en el Departamento de Cirugía Gastrointestinal del Primer Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Anhui.
Estudie la eficacia de la solución de separación de linfocitos para separar PBMC de la sangre venosa periférica de pacientes con cáncer gástrico y observe los efectos del tiempo de centrifugación (X1) y la velocidad de centrifugación (X2) en el espesor de la capa de separación de PBMC (Y) después de la centrifugación. Con base en los resultados de los experimentos preliminares y la literatura, se determinó que el rango de tiempo de centrifugación es de 10 a 30 minutos y el rango de velocidad de centrifugación es de 1000 a 3000 r/min. El espesor de la capa de separación de PBMC se utilizó como variable de reacción y se fijó el objetivo de maximizarla. En el modelo se seleccionaron interacciones cuadráticas y potencias de dos. Defina restricciones de factores: 1X1+1X2≤3025, 1X1+1X2≥1020, condiciones de separación de PBMC diseñadas a medida, redondee a números enteros cuando X1 y X2 encuentren decimales, un total de 12 experimentos (tabla a continuación).
PBMC Método de separación
Recoja 4 ml de sangre venosa periférica del paciente en un tubo anticoagulante que contenga EDTA. En un tubo de centrífuga de 15 ml, colóquelo a 1 cm del nivel de líquido Ficoll y agregue lentamente sangre a lo largo de la pared del tubo hasta el nivel de líquido Ficoll. Centrifugar a 20°C según los parámetros de los resultados del diseño personalizado. Después de la centrifugación, se divide en cuatro capas desde el fondo del tubo hasta la superficie del líquido, a saber, la capa de glóbulos rojos y granulocitos, la capa de líquido estratificado, la capa de células mononucleares y la capa de plasma.
PBMC Medición de espesor centrífugo
El tubo de centrífuga separado se fijó en la pared vertical con cinta adhesiva, se fijó la cámara digital al nivel de la capa de nubes de PBMC y se ajustó el enfoque para tomar fotografías. Coloque la foto en el software Photoshop CS y mida el espesor de la capa de nubes: se utiliza como referencia la longitud física de la escala de 100 mm en la misma imagen del tubo de ensayo. Utilice la herramienta regla para medir la longitud del elemento. El panel de información lee los datos y los registra. Se utiliza el mismo método para medir el espesor de las PBMC (la longitud del elemento), calcula la longitud física (espesor a medir) de la capa de nubes de PBMC de acuerdo con la siguiente fórmula:
PBMC Ensayo de vitalidad
De acuerdo con las condiciones optimizadas obtenidas mediante el análisis del software JMP, centrifugue las PBMC. Inserte la pipeta en la capa de nube, succione suavemente la capa de nube, colóquela en un nuevo tubo de centrífuga, agregue 3 veces el volumen de PBMC en PBS, 20° C, 2000r, 10min, lavar dos veces y descartar el sobrenadante. Agregue 500 ul de PBS para diluir y preparar una suspensión de células individuales. Pipetee 450 ul de la suspensión anterior en el tubo EP, agregue 50 ul de solución de azul tripán y mezcle la suspensión celular y la solución de azul tripán al 0,4% 9:1 (concentración final 0,04%). Tome fotografías en 3 minutos, marque y cuente manualmente las células vivas y muertas utilizando el software PS. Observadas al microscopio, las células muertas se tiñen de azul, mientras que las células vivas se niegan a teñirse y aparecen incoloras y transparentes. Calcule la tasa de supervivencia celular: Tasa de supervivencia celular (%) = número total de células vivas/(número total de células vivas + número total de células muertas) × 100%.
JMP El software analiza los datos de los resultados del diseño personalizado y utiliza el método de mínimos cuadrados estándar para analizar los efectos principales, los efectos secundarios y las interacciones del tiempo y la velocidad de centrifugación. PAG ＜ 0,05 La diferencia es estadísticamente significativa.
resultados y análisis
PBMC resultados de la medición de espesor
Se obtuvieron doce experimentos utilizando el diseño personalizado de JMP. De acuerdo con el tiempo de centrifugación específico y los parámetros de velocidad de centrifugación en cada experimento, se realizó la centrifugación. Después de la centrifugación, se tomaron fotografías. Se utilizó el software Photoshop para medir el espesor de las PBMC en el tubo de centrífuga. Los resultados se muestran en la Tabla 1.
Tabla 1 Resultados de la medición del espesor de PBMC en diferentes condiciones de centrifugación
Tiempo de centrifugación y velocidad de centrifugación. PBMC Efecto del espesor
Se utilizó el software JMP para ajustar el modelo y se utilizó el método estándar de mínimos cuadrados para detectar los efectos. El efecto principal, el efecto secundario y la interacción de los dos factores de tiempo y velocidad de centrifugación afectaron el espesor de las PBMC (Tabla 2).
Tabla 2 Efecto de los factores de separación centrífuga sobre el espesor de PBMC
Los efectos del tiempo de centrifugación, la velocidad de centrifugación y su interacción sobre el espesor de las PBMC fueron todos estadísticamente significativos, P<0,05; la interacción entre el tiempo y la velocidad no fue estadísticamente significativa (P>0,05). Según la clasificación del software de los valores estimados de cada parámetro (Tabla 3), el impacto del tiempo de centrifugación es mayor que la velocidad de centrifugación.
Tabla 3 Estimaciones de parámetros después de la clasificación
Ajuste del modelo
Análisis de variación del modelo ajustado por el método de mínimos cuadrados estándar (Tabla 4). Los cuadrados medios del modelo y el error son 0.191981 y 0.021543 respectivamente. El valor F es 8.911. La P del modelo es <0.01, lo que indica que el modelo ajustado El modelo está en el nivel de α=0,01 es significativo.
Tabla 4 Análisis de variación del modelo de diseño experimental personalizado
Se puede ver la relación entre el valor predicho y el valor real en el modelo de ajuste (Figura 1): el coeficiente de determinación R2 = 0,88, lo que indica que el modelo puede explicar el 88% de la variación y el modelo se ajusta bien.
Figura 1 Relación entre los valores previstos y los valores reales
dibujo de superficie
El modelo se ajustó según el método estándar de mínimos cuadrados y se utilizó el software JMP para realizar la caracterización de los factores (perfilador de superficie). El modelo con las variables de reacción se mostró como una superficie para obtener un gráfico de superficie (Figura 2). El valor máximo de la variable de reacción, es decir, el espesor de PBMC, se puede encontrar de forma intuitiva y se puede observar la interacción entre el tiempo de centrifugación y la velocidad de centrifugación.
Figura 2 Gráfico de superficie de la interacción entre el tiempo de centrifugación y la velocidad que afectan el espesor de las PBMC
Configuración óptima del perfilador de predicción
Seleccione Maximizar voluntad en el perfilador de predicción del software JMP, y el software ajusta automáticamente el gráfico del perfil de predicción para obtener la configuración óptima para el espesor máximo de PBMC (Figura 3). Se descubrió que se utilizó centrifugación en gradiente de densidad para separar las PBMC de las sangre periférica de pacientes con cáncer gástrico y obtener el espesor máximo de PBMC. El método es: el tiempo de centrifugación es de 10 minutos y la velocidad de centrifugación se establece en 2306.962 r/min, que es aproximadamente 2307 r/min. Este experimento predice que, en las condiciones anteriores, el valor teórico del espesor de PBMC es 2,596923 mm, IC del 95 % (2,34213, 2,85171).
Figura 3 Configuración del generador de perfiles de predicción para maximizar la disposición
Ensayo de viabilidad celular en condiciones optimizadas.
Tiempo de centrifugación = 10 min, velocidad de centrifugación = 2307 r/min y las PBMC obtenidas por centrifugación se tiñeron con azul tripán (Figura 4). El número total de células fue 199, el número total de células muertas fue 8 y la tasa de supervivencia celular fue del 95%.
Figura 4 Tinción con azul tripán de PBMC (× 10)
conversar
La centrifugación en gradiente de densidad se usa ampliamente para separar PBMC (Zhao Jie et al., 2014), pero diferentes unidades e investigadores usan diferentes tiempos y velocidades de centrifugación para separar PBMC, y hay pocos informes bibliográficos sobre los efectos de la separación (Huang et al., 2014; Saidijam et al., 2014), la falta de directrices y procedimientos operativos estándar dio lugar a una falta de coherencia y comparabilidad de los resultados experimentales, y a una baja eficiencia de algunas separaciones centrífugas, lo que afectó la realización de experimentos posteriores.
Este estudio utilizó el software JMP para un diseño personalizado, utilizando el espesor centrífugo de PBMC como variable de reacción, el tiempo de centrifugación y la velocidad de centrifugación como variables factoriales, y obtuvo 12 experimentos. El espesor de PBMC centrifugado se midió usando Photoshop CS6.0 y se analizó mediante mínimos cuadrados estándar. Se encontró que: los efectos principales del tiempo de centrifugación, la velocidad de centrifugación y sus efectos secundarios afectaron el espesor de las PBMC; la interacción entre el tiempo de centrifugación y la velocidad de centrifugación no fue estadísticamente significativa.
El coeficiente de determinación R2=0,88 del modelo establecido puede explicar el 88% de la variación de la respuesta. El espesor de PBMC previsto concuerda bien con el valor real. Las condiciones óptimas de separación obtenidas mediante predicción y caracterización: tiempo de centrifugación = 10 min, velocidad de centrifugación = 2307 r/min, espesor previsto de PBMC = 2,596923 mm, IC del 95 % (2,34213, 2,85171), espesor real = 2,7 mm, tinción con azul tripán, supervivencia de células encontradas tasa = 95%.
Los efectos secundarios del tiempo de centrifugación y la velocidad de centrifugación no tienen importancia práctica durante las operaciones experimentales. Las condiciones óptimas encontradas en este estudio son inconsistentes con el informe de Cai Minmin et al. (Cai Minmin et al., 2016), las principales razones son:
- El esquema de diseño es diferente. Cai Minmin et al. solo utilizaron un diseño experimental grupal. Este estudio utilizó el software JMP para implementar un diseño experimental personalizado. Este método de diseño se basa en modelos matemáticos y los resultados estadísticos son más científicos y avanzados (Shi Zhijia et al. otros, 2010);
- Existen ciertas diferencias en los objetos de investigación;
- Puede haber ciertas diferencias en otras condiciones experimentales como la temperatura;
- Existen diferencias en las marcas de equipos experimentales como las centrífugas.
El análisis del perfilador predictivo encontró que los efectos principales del tiempo de centrifugación, la velocidad de centrifugación y el espesor de las PBMC variables de reacción mostraron una relación curvilínea. A medida que aumentaba el tiempo de centrifugación, el espesor de las PBMC primero disminuía y luego aumentaba. A medida que aumentaba la velocidad de centrifugación, las PBMC espesor El espesor primero aumenta y luego disminuye, lo que indica que la influencia de las variables factoriales, es decir, el tiempo y la velocidad de centrifugación, en el espesor de las PBMC es compleja y no una simple correlación lineal, que merece atención durante el experimento.
Este estudio utilizó el tiempo de centrifugación óptimo y la velocidad de centrifugación simulada y calculada por el perfilador de factores para la verificación y encontró que el espesor real de PBMC estaba dentro del rango de espesor previsto, lo que indica que el modelo se ajustaba bien. La tinción con azul tripán mostró que las células obtenidas por centrifugación en condiciones óptimas tienen una mayor tasa de supervivencia y pueden usarse para investigaciones experimentales posteriores. Este estudio proporciona un nuevo método para la optimización de las condiciones de centrifugación de PBMC de sangre periférica en pacientes con cáncer gástrico.
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