Il cancro gastrico è una causa comune di morte per cancro e il suo tasso di incidenza rimane elevato nel mio paese, mettendo seriamente a rischio la salute delle persone (Zheng Ying e Wu Chunxiao, 2016). Le cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC) sono strettamente correlate alla prognosi di sopravvivenza del cancro gastrico (Tsai et al., 2013), le PBMC hanno una funzione immunitaria (Lv Qiuju et al., 2015) e hanno un significativo valore di ricerca clinica e biologica (Kim et al., 2016), ampiamente utilizzato nella ricerca sul trattamento dei tumori (Koeck et al., 2016). Tuttavia, non esiste consenso sulle condizioni per isolare le PBMC dal sangue venoso periferico (Moreli et al., 2016; Corkum et al., 2015; Dai Guangming et al., 2014), che necessita urgentemente di ricerche approfondite.
La progettazione sperimentale basata sul software JMP può ottenere risultati affidabili con un numero inferiore di esperimenti con la premessa di un controllo efficace degli errori (Wu Fan et al., 2016). Questo studio utilizza il software JMP per personalizzare le condizioni di separazione delle PBMC e ottimizzare il tempo e la velocità di centrifugazione, fornendo una base per l'ottimizzazione, la ricerca di base e clinica della separazione delle PBMC nei pazienti con cancro gastrico.
Materiali e metodi
Il sangue venoso utilizzato in questo esperimento è stato raccolto da pazienti affetti da cancro gastrico presso il Dipartimento di Chirurgia Gastrointestinale del Primo Ospedale Affiliato dell'Università di Medicina di Anhui.
Studiare l'efficienza della soluzione di separazione dei linfociti nel separare le PBMC dal sangue venoso periferico dei pazienti affetti da cancro gastrico e osservare gli effetti del tempo di centrifugazione (X1) e della velocità di centrifugazione (X2) sullo spessore dello strato di separazione delle PBMC (Y) dopo la centrifugazione. Sulla base dei risultati degli esperimenti preliminari e della letteratura, è stato determinato che l'intervallo di tempo di centrifugazione è 10~30 minuti e l'intervallo di velocità di centrifugazione è 1000~3000 giri/min. Lo spessore dello strato di separazione PBMC è stato utilizzato come variabile di reazione e l'obiettivo era quello di massimizzarlo. Nel modello sono state selezionate le interazioni quadratiche e le potenze di due. Definire i vincoli fattoriali: 1X1+1X2≤3025, 1X1+1X2≥1020, condizioni di separazione PBMC personalizzate, arrotondamento a numeri interi quando X1 e X2 incontrano decimali, per un totale di 12 esperimenti (tabella seguente).
PBMC Metodo di separazione
Raccogliere 4 ml di sangue venoso periferico del paziente in una provetta anticoagulante contenente EDTA.In una provetta da centrifuga da 15 ml, posizionare a 1 cm di distanza dal livello del liquido Ficoll e aggiungere lentamente il sangue lungo la parete della provetta fino al livello del liquido Ficoll. Centrifugare a 20°C secondo i parametri dei risultati del progetto personalizzato. Dopo la centrifugazione, viene diviso in quattro strati dal fondo della provetta alla superficie del liquido, vale a dire lo strato di globuli rossi e granulociti, lo strato liquido stratificato, lo strato strato di cellule mononucleari e strato di plasma.
PBMC Misurazione centrifuga dello spessore
La provetta da centrifuga separata è stata fissata sulla parete verticale con nastro adesivo, ha fissato la fotocamera digitale a livello dello strato nuvoloso PBMC e ha regolato la messa a fuoco per scattare foto. Inserisci la foto nel software Photoshop CS e misura lo spessore dello strato di nuvole: la lunghezza fisica della scala di 100 mm nella stessa immagine in provetta viene utilizzata come riferimento. Utilizza lo strumento righello per misurare la lunghezza dell'elemento. legge i dati e li registra. Lo stesso metodo viene utilizzato per misurare lo spessore del PBMC (la lunghezza dell'elemento), calcolare la lunghezza fisica (spessore da misurare) dello strato nuvoloso del PBMC secondo la seguente formula:
PBMC Saggio di vitalità
Secondo le condizioni ottimizzate ottenute tramite l'analisi del software JMP, centrifugare il PBMC. Inserire la pipetta nello strato nuvoloso, aspirare delicatamente lo strato nuvoloso, posizionarlo in una nuova provetta da centrifuga, aggiungere 3 volte il volume di PBMC in PBS, 20° C, 2000r, 10min, lavare due volte ed eliminare il surnatante. Aggiungere 500ul di PBS da diluire per preparare una sospensione cellulare singola. Pipettare 450 ul della sospensione di cui sopra nella provetta EP, aggiungere 50 ul di soluzione di trypan blu e mescolare la sospensione cellulare e la soluzione di trypan blu allo 0,4% 9:1 (concentrazione finale 0,04%). Scatta foto entro 3 minuti, contrassegna e conta manualmente le cellule vive e le cellule morte utilizzando il software PS. Osservate al microscopio, le cellule morte si colorano di blu, mentre le cellule vive rifiutano di colorarsi e appaiono incolori e trasparenti. Calcolare il tasso di sopravvivenza cellulare: tasso di sopravvivenza cellulare (%) = numero totale di cellule viventi/(numero totale di cellule viventi + numero totale di cellule morte) × 100%.
JMP Il software analizza i dati dei risultati della progettazione personalizzata e utilizza il metodo dei minimi quadrati standard per analizzare gli effetti principali, gli effetti secondari e le interazioni del tempo di centrifugazione e della velocità di centrifugazione. P ＜ 0,05 La differenza è statisticamente significativa.
risultati e analisi
PBMC risultati della misurazione dello spessore
Sono stati ottenuti dodici esperimenti utilizzando il design personalizzato di JMP. In base ai parametri specifici del tempo di centrifugazione e della velocità di centrifugazione in ciascun esperimento, è stata eseguita la centrifugazione. Dopo la centrifugazione, sono state scattate delle foto. È stato utilizzato il software Photoshop per misurare lo spessore di PBMC nella provetta da centrifuga. i risultati sono mostrati nella Tabella 1.
Tabella 1 Risultati della misurazione dello spessore del PBMC in diverse condizioni di centrifugazione
Tempo di centrifugazione e velocità di centrifugazione PBMC Effetto dello spessore
Per adattare il modello è stato utilizzato il software JMP e per schermare gli effetti è stato utilizzato il metodo standard dei minimi quadrati. L'effetto principale, l'effetto secondario e l'interazione dei due fattori tempo di centrifugazione e velocità hanno influenzato lo spessore del PBMC (Tabella 2).
Tabella 2 Effetto dei fattori di separazione centrifuga sullo spessore del PBMC
Gli effetti del tempo di centrifugazione, della velocità di centrifugazione e della loro interazione sullo spessore delle PBMC erano tutti statisticamente significativi, P<0,05; l'interazione tra tempo e velocità non era statisticamente significativa (P>0,05). Secondo la classifica software dei valori stimati di ciascun parametro (Tabella 3), l'impatto del tempo di centrifugazione è maggiore della velocità di centrifugazione.
Tabella 3 Stime dei parametri dopo l'ordinamento
Vestibilità del modello
Analisi della variazione del modello adattato con il metodo dei minimi quadrati standard (Tabella 4). La media dei quadrati del modello e dell'errore sono rispettivamente 0,191981 e 0,021543. Il valore F è 8,911. La P del modello è <0,01, indicando che il modello adattato il modello è al livello di α=0,01 ed è significativo.
Tabella 4 Analisi delle variazioni del modello di disegno sperimentale personalizzato
Si può vedere la relazione tra il valore previsto e il valore effettivo nel modello di adattamento (Figura 1): il coefficiente di determinazione R2=0,88, indica che il modello può spiegare l'88% della variazione e il modello si adatta bene.
Figura 1 Relazione tra valori previsti e valori effettivi
Disegno della superficie
Il modello è stato adattato secondo il metodo dei minimi quadrati standard e il software JMP è stato utilizzato per eseguire la caratterizzazione dei fattori (profilatore di superficie). Il modello con le variabili di reazione è stato visualizzato come superficie per ottenere un grafico di superficie (Figura 2). Il valore massimo della variabile di reazione, ovvero lo spessore del PBMC, può essere trovato in modo intuitivo e si può osservare l'interazione tra il tempo di centrifugazione e la velocità di centrifugazione.
Figura 2 Grafico superficiale dell'interazione tra il tempo di centrifugazione e la velocità che influenza lo spessore del PBMC
Impostazioni ottimali del profiler di previsione
Selezionare Massimizza disponibilità nel profilatore di previsione del software JMP e il software regolerà automaticamente il grafico del profilo di previsione per ottenere l'impostazione ottimale per lo spessore massimo del PBMC (Figura 3). È stato riscontrato che la centrifugazione in gradiente di densità è stata utilizzata per separare il PBMC dal sangue periferico di pazienti affetti da cancro gastrico e ottenere lo spessore massimo di PBMC. Il metodo è: il tempo di centrifugazione è di 10 minuti e la velocità di centrifugazione è impostata su 2306,962 giri/min, ovvero circa 2307 giri/min. Questo esperimento prevede che nelle condizioni di cui sopra, il valore teorico dello spessore del PBMC è 2,596923 mm, 95%CI (2,34213, 2,85171).
Figura 3 Impostazioni del profiler di previsione per massimizzare la disponibilità
Saggio di vitalità cellulare in condizioni ottimizzate
Tempo di centrifugazione = 10 min, velocità di centrifugazione = 2307 giri/min e le PBMC ottenute mediante centrifugazione sono state colorate con trypan blu (Figura 4). Il numero totale di cellule era 199, il numero totale di cellule morte era 8 e il tasso di sopravvivenza cellulare era del 95%.
Figura 4 Colorazione trypan blue PBMC (×10)
discutere
La centrifugazione in gradiente di densità è ampiamente utilizzata per separare i PBMC (Zhao Jie et al., 2014), ma diverse unità e ricercatori utilizzano tempi di centrifugazione e velocità di centrifugazione diversi per separare i PBMC, e ci sono pochi rapporti in letteratura sugli effetti della separazione (Huang et al., 2014; Saidijam et al., 2014), la mancanza di procedure operative standard e di linee guida ha comportato una mancanza di coerenza e comparabilità dei risultati sperimentali e una bassa efficienza di alcune separazioni centrifughe, che hanno influenzato la conduzione degli esperimenti successivi.
Questo studio ha utilizzato il software JMP per la progettazione personalizzata, utilizzando lo spessore centrifugo del PBMC come variabile di reazione, il tempo di centrifugazione e la velocità di centrifugazione come variabili fattore e ha ottenuto 12 esperimenti. Lo spessore del PBMC centrifugato è stato misurato utilizzando Photoshop CS6.0 e analizzato mediante i minimi quadrati standard Si è riscontrato che: gli effetti principali del tempo di centrifugazione, della velocità di centrifugazione e i loro effetti secondari hanno tutti influenzato lo spessore del PBMC; l'interazione tra tempo di centrifugazione e velocità di centrifugazione non era statisticamente significativa.
Il coefficiente di determinazione R2=0,88 del modello stabilito può spiegare l'88% della variazione della risposta. Lo spessore PBMC previsto è in buon accordo con il valore effettivo. Le condizioni di separazione ottimali ottenute mediante previsione e caratterizzazione: tempo di centrifugazione = 10 minuti, velocità di centrifugazione = 2307 giri/min, spessore PBMC previsto = 2,596923 mm, IC al 95% (2,34213, 2,85171), spessore effettivo = 2,7 mm, cellule trovate mediante colorazione con trypan blu. Sopravvivenza tasso = 95%.
Gli effetti secondari del tempo e della velocità di centrifugazione non hanno alcun significato pratico durante le operazioni sperimentali. Le condizioni ottimali trovate in questo studio non sono coerenti con il rapporto di Cai Minmin et al. (Cai Minmin et al., 2016). Le ragioni principali sono:
- Lo schema di progettazione è diverso. Cai Minmin et al. hanno utilizzato solo la progettazione sperimentale di gruppo. Questo studio ha utilizzato il software JMP per implementare una progettazione sperimentale personalizzata. Questo metodo di progettazione si basa su modelli matematici e i risultati statistici sono più scientifici e avanzati (Shi Zhijia et al. al., 2010);
- Ci sono alcune differenze negli oggetti di ricerca;
- Potrebbero esserci alcune differenze in altre condizioni sperimentali come la temperatura;
- Esistono differenze nelle marche di apparecchiature sperimentali come le centrifughe.
L'analisi predittiva del profiler ha rilevato che gli effetti principali del tempo di centrifugazione, della velocità di centrifugazione e dello spessore PBMC variabile della reazione mostravano tutti una relazione curvilinea. All'aumentare del tempo di centrifugazione, lo spessore del PBMC prima diminuiva e poi aumentava. All'aumentare della velocità di centrifugazione, lo spessore del PBMC spessore Lo spessore prima aumenta e poi diminuisce, indicando che l'influenza delle variabili fattore, vale a dire il tempo di centrifugazione e la velocità, sullo spessore del PBMC è complessa e non una semplice correlazione lineare, che merita attenzione durante l'esperimento.
Questo studio ha utilizzato il tempo di centrifugazione e la velocità di centrifugazione ottimali simulati e calcolati dal profiler del fattore per la verifica e ha rilevato che lo spessore effettivo del PBMC rientrava nell'intervallo di spessore previsto, indicando che il modello si adattava bene. La colorazione con trypan blue ha mostrato che le cellule ottenute mediante centrifugazione in condizioni ottimali hanno un tasso di sopravvivenza più elevato e possono essere utilizzate per successive ricerche sperimentali. Questo studio fornisce un nuovo metodo per l'ottimizzazione delle condizioni di centrifugazione per PBMC del sangue periferico nei pazienti con cancro gastrico.
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