Magenkrebs ist eine häufige Krebstodesursache und die Inzidenzrate ist in meinem Land nach wie vor hoch und stellt eine ernsthafte Bedrohung für die Gesundheit der Menschen dar (Zheng Ying und Wu Chunxiao, 2016). Periphere mononukleäre Blutzellen (PBMC) stehen in engem Zusammenhang mit der Überlebensprognose von Magenkrebs (Tsai et al., 2013), PBMC haben eine Immunfunktion (Lv Qiuju et al., 2015) und haben einen erheblichen klinischen und biologischen Forschungswert (Kim et al., 2016), weit verbreitet in der Tumorbehandlungsforschung (Koeck et al., 2016). Es besteht jedoch kein Konsens über die Bedingungen für die Isolierung von PBMC aus peripherem venösem Blut (Moreli et al., 2016; Corkum et al., 2015; Dai Guangming et al., 2014), die dringend einer eingehenden Forschung bedarf.
Experimentelles Design auf Basis der JMP-Software kann unter der Voraussetzung einer effektiven Fehlerkontrolle mit einer geringeren Anzahl von Experimenten zuverlässige Ergebnisse erzielen (Wu Fan et al., 2016). Diese Studie verwendet JMP-Software, um die Trennungsbedingungen von PBMC anzupassen und die Zentrifugationszeit und -geschwindigkeit zu optimieren. Dies bietet eine Grundlage für die Optimierung, Grundlagenforschung und klinische Forschung der PBMC-Trennung bei Magenkrebspatienten.
Materialen und Methoden
Das in diesem Experiment verwendete venöse Blut wurde von Magenkrebspatienten in der Abteilung für Magen-Darm-Chirurgie des First Affiliated Hospital der Anhui Medical University gesammelt.
Untersuchen Sie die Effizienz der Lymphozyten-Trennlösung bei der Trennung von PBMC aus peripherem venösem Blut von Magenkrebspatienten und beobachten Sie die Auswirkungen der Zentrifugationszeit (X1) und der Zentrifugationsgeschwindigkeit (X2) auf die Dicke der PBMC-Trennschicht (Y) nach der Zentrifugation. Basierend auf den Ergebnissen vorläufiger Experimente und der Literatur wurde festgestellt, dass der Zentrifugationszeitbereich 10 bis 30 Minuten und der Zentrifugationsgeschwindigkeitsbereich 1000 bis 3000 U/min beträgt. Die Dicke der PBMC-Trennschicht wurde als Reaktionsvariable verwendet und als Ziel wurde eine Maximierung festgelegt. Im Modell wurden quadratische Wechselwirkungen und Zweierpotenzen ausgewählt. Definieren Sie Faktorbeschränkungen: 1X1+1X2≤3025, 1X1+1X2≥1020, kundenspezifische PBMC-Trennbedingungen, Aufrunden auf ganze Zahlen, wenn X1 und X2 auf Dezimalstellen treffen, insgesamt 12 Experimente (Tabelle unten).
PBMC Trennmethode
Sammeln Sie 4 ml des peripheren venösen Blutes des Patienten in einem Antikoagulansröhrchen mit EDTA. Platzieren Sie ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen 1 cm vom Ficoll-Flüssigkeitsspiegel entfernt und geben Sie langsam Blut entlang der Röhrchenwand bis zum Ficoll-Flüssigkeitsspiegel hinzu. Zentrifugieren Sie bei 20 °C gemäß den Parametern der kundenspezifischen Designergebnisse. Nach der Zentrifugation wird es vom Boden des Röhrchens bis zur Flüssigkeitsoberfläche in vier Schichten unterteilt, nämlich die rote Blutkörperchen- und Granulozytenschicht, die geschichtete Flüssigkeitsschicht mononukleäre Zellschicht und die Plasmaschicht.
PBMC Zentrifugale Dickenmessung
Das abgetrennte Zentrifugenröhrchen wurde mit Klebeband an der vertikalen Wand befestigt, die Digitalkamera auf Höhe der PBMC-Wolkenschicht fixiert und der Fokus zum Aufnehmen von Fotos angepasst. Geben Sie das Foto in die Photoshop CS-Software ein und messen Sie die Dicke der Wolkenschicht: Die physische Länge der 100-mm-Skala im selben Reagenzglasbild wird als Referenz verwendet. Verwenden Sie das Lineal-Werkzeug, um die Länge des Elements zu messen. Das Informationsfeld liest die Daten und zeichnet sie auf. Die gleiche Methode wird verwendet, um die Dicke des PBMC (die Länge des Elements) zu messen. ), berechnet die physikalische Länge (zu messende Dicke) der PBMC-Wolkenschicht gemäß der folgenden Formel:
PBMC Vitalitätstest
Zentrifugieren Sie die PBMC gemäß den durch die JMP-Softwareanalyse optimierten Bedingungen. Führen Sie die Pipette in die Trübungsschicht ein, saugen Sie die Trübungsschicht vorsichtig heraus, geben Sie sie in ein neues Zentrifugenröhrchen und geben Sie das dreifache Volumen an PBMC in PBS bei 20° hinzu C, 2000r, 10min, zweimal waschen und den Überstand verwerfen. Fügen Sie 500 μl PBS hinzu, um es zu verdünnen und eine Einzelzellsuspension herzustellen. Pipettieren Sie 450 µl der obigen Suspension in das EP-Röhrchen, geben Sie 50 µl Trypanblau-Lösung hinzu und mischen Sie die Zellsuspension und die 0,4 %ige Trypanblau-Lösung im Verhältnis 9:1 (Endkonzentration 0,04 %). Machen Sie innerhalb von 3 Minuten Fotos, markieren und zählen Sie lebende und tote Zellen manuell mit der PS-Software. Unter dem Mikroskop sind tote Zellen blau gefärbt, während lebende Zellen sich nicht anfärben lassen und farblos und transparent erscheinen. Berechnen Sie die Zellüberlebensrate: Zellüberlebensrate (%) = Gesamtzahl lebender Zellen/(Gesamtzahl lebender Zellen + Gesamtzahl toter Zellen) × 100 %.
JMP Die Software analysiert die benutzerdefinierten Design-Ergebnisdaten und verwendet die standardmäßige Methode der kleinsten Quadrate, um die Haupteffekte, Nebeneffekte und Wechselwirkungen zwischen Zentrifugationszeit und Zentrifugationsgeschwindigkeit zu analysieren. P ＜ 0,05 Der Unterschied ist statistisch signifikant.
Ergebnisse und Analyse
PBMC Ergebnisse der Dickenmessung
Zwölf Experimente wurden mit JMP-Sonderdesign durchgeführt. Entsprechend der spezifischen Zentrifugationszeit und den Zentrifugationsgeschwindigkeitsparametern in jedem Experiment wurde eine Zentrifugation durchgeführt. Nach der Zentrifugation wurden Fotos aufgenommen. Mit Photoshop-Software wurde die Dicke von PBMC im Zentrifugenröhrchen gemessen. Die Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 aufgeführt.
Tabelle 1 Ergebnisse der PBMC-Dickenmessung unter verschiedenen Zentrifugationsbedingungen
Zentrifugationszeit und Zentrifugationsgeschwindigkeit PBMC Wirkung der Dicke
JMP-Software wurde verwendet, um das Modell anzupassen, und die Standardmethode der kleinsten Quadrate wurde verwendet, um die Effekte zu überprüfen. Der Haupteffekt, der sekundäre Effekt und das Zusammenspiel der beiden Faktoren Zentrifugationszeit und -geschwindigkeit beeinflussten die Dicke von PBMC (Tabelle 2).
Tabelle 2 Einfluss der Zentrifugaltrennfaktoren auf die PBMC-Dicke
Die Auswirkungen der Zentrifugationszeit, der Zentrifugationsgeschwindigkeit und ihrer Wechselwirkung auf die PBMC-Dicke waren alle statistisch signifikant, P < 0,05; die Wechselwirkung zwischen Zeit und Geschwindigkeit war statistisch nicht signifikant (P > 0,05). Gemäß der Software-Rangfolge der geschätzten Werte jedes Parameters (Tabelle 3) ist der Einfluss der Zentrifugationszeit größer als die Zentrifugationsgeschwindigkeit.
Tabelle 3 Parameterschätzungen nach dem Sortieren
Modellpassform
Variationsanalyse des Modells, das mit der Standardmethode der kleinsten Quadrate angepasst wurde (Tabelle 4). Die mittleren Quadrate des Modells und der Fehler betragen 0,191981 bzw. 0,021543. Der F-Wert beträgt 8,911. Der P des Modells ist <0,01, was darauf hinweist, dass die Anpassung erfolgt Das Modell liegt auf dem Niveau von α=0,01. ist signifikant.
Tabelle 4 Variationsanalyse des angepassten experimentellen Designmodells
Die Beziehung zwischen dem vorhergesagten Wert und dem tatsächlichen Wert im Anpassungsmodell (Abbildung 1) ist ersichtlich: Das Bestimmtheitsmaß R2 = 0,88, was darauf hinweist, dass das Modell 88 % der Variation erklären kann und das Modell gut passt.
Abbildung 1 Beziehung zwischen vorhergesagten Werten und tatsächlichen Werten
Oberflächenzeichnung
Das Modell wurde nach der Standardmethode der kleinsten Quadrate angepasst und JMP-Software wurde zur Faktorcharakterisierung (Oberflächenprofiler) verwendet. Das Modell mit Reaktionsvariablen wurde als Oberfläche angezeigt, um ein Oberflächendiagramm zu erhalten (Abbildung 2). Der Maximalwert der Reaktionsvariablen, also die PBMC-Dicke, lässt sich intuitiv ermitteln und die Wechselwirkung zwischen Zentrifugationszeit und Zentrifugationsgeschwindigkeit beobachten.
Abbildung 2 Oberflächendiagramm der Wechselwirkung zwischen Zentrifugationszeit und -geschwindigkeit, die sich auf die PBMC-Dicke auswirkt
Optimale Einstellungen für den Vorhersage-Profiler
Wählen Sie „Bereitschaft maximieren“ im Vorhersageprofiler der JMP-Software aus, und die Software passt das Vorhersageprofildiagramm automatisch an, um die optimale Einstellung für die maximale PBMC-Dicke zu erhalten (Abbildung 3). Es wurde festgestellt, dass Dichtegradientenzentrifugation verwendet wurde, um PBMC vom zu trennen peripheres Blut von Magenkrebspatienten und erhalten die maximale Dicke von PBMC. Die Methode ist: Die Zentrifugationszeit beträgt 10 Minuten und die Zentrifugationsgeschwindigkeit ist auf 2306,962 U/min eingestellt, was ungefähr 2307 U/min entspricht. Dieses Experiment sagt voraus, dass unter den oben genannten Bedingungen der theoretische Wert der PBMC-Dicke 2,596923 mm, 95 % CI (2,34213, 2,85171) beträgt.
Abbildung 3 Einstellungen des Vorhersageprofilers zur Maximierung der Bereitschaft
Zelllebensfähigkeitstest unter optimierten Bedingungen
Zentrifugationszeit = 10 min, Zentrifugationsgeschwindigkeit = 2307 U/min, und die durch Zentrifugation erhaltenen PBMC wurden mit Trypanblau gefärbt (Abbildung 4). Die Gesamtzahl der Zellen betrug 199, die Gesamtzahl der toten Zellen betrug 8 und die Überlebensrate der Zellen betrug 95 %.
Abbildung 4 PBMC-Trypanblau-Färbung (×10)
diskutieren
Dichtegradientenzentrifugation wird häufig zur Trennung von PBMCs verwendet (Zhao Jie et al., 2014), aber verschiedene Einheiten und Forscher verwenden unterschiedliche Zentrifugationszeiten und Zentrifugationsgeschwindigkeiten, um PBMCs zu trennen, und es gibt nur wenige Literaturberichte über Trennungseffekte (Huang et al., 2014). 2014; Saidijam et al., 2014) führte das Fehlen von Standardarbeitsanweisungen und -richtlinien zu mangelnder Konsistenz und Vergleichbarkeit der Versuchsergebnisse sowie zu einer geringen Effizienz einiger Zentrifugaltrennungen, was sich auf die Durchführung nachfolgender Experimente auswirkte.
Diese Studie verwendete JMP-Software für ein individuelles Design, wobei die PBMC-Zentrifugaldicke als Reaktionsvariable, die Zentrifugationszeit und die Zentrifugationsgeschwindigkeit als Faktorvariablen verwendet wurden, und es wurden 12 Experimente erhalten. Die zentrifugierte PBMC-Dicke wurde mit Photoshop CS6.0 gemessen und anhand der standardmäßigen kleinsten Quadrate analysiert Methode. Es wurde festgestellt, dass: die Haupteffekte der Zentrifugationszeit, der Zentrifugationsgeschwindigkeit und ihre sekundären Effekte alle die Dicke von PBMC beeinflussten; die Wechselwirkung zwischen Zentrifugationszeit und Zentrifugationsgeschwindigkeit war statistisch nicht signifikant.
Das Bestimmtheitsmaß R2=0,88 des etablierten Modells kann 88 % der Antwortvariation erklären. Die vorhergesagte PBMC-Dicke stimmt gut mit dem tatsächlichen Wert überein. Die durch Vorhersage und Charakterisierung erhaltenen optimalen Trennbedingungen: Zentrifugationszeit = 10 Minuten, Zentrifugationsgeschwindigkeit = 2307 U/min, vorhergesagte PBMC-Dicke = 2,596923 mm, 95 % CI (2,34213, 2,85171), tatsächliche Dicke = 2,7 mm, Trypanblau-Färbung, Überleben der gefundenen Zellen Quote = 95 %.
Die sekundären Effekte der Zentrifugationszeit und der Zentrifugationsgeschwindigkeit haben im Versuchsbetrieb keine praktische Bedeutung. Die in dieser Studie gefundenen optimalen Bedingungen stehen im Widerspruch zum Bericht von Cai Minmin et al. (Cai Minmin et al., 2016). Die Hauptgründe sind:
- Das Entwurfsschema ist anders. Cai Minmin et al. verwendeten nur Gruppenversuchsdesign. In dieser Studie wurde JMP-Software verwendet, um ein individuelles Versuchsdesign zu implementieren. Diese Entwurfsmethode basiert auf mathematischen Modellen und die statistischen Ergebnisse sind wissenschaftlicher und fortschrittlicher (Shi Zhijia et al., 2010);
- Es gibt gewisse Unterschiede bei den Forschungsobjekten;
- Bei anderen Versuchsbedingungen wie der Temperatur kann es gewisse Unterschiede geben;
- Es gibt Unterschiede bei den Marken experimenteller Geräte wie Zentrifugen.
Eine prädiktive Profilanalyse ergab, dass die Haupteffekte der Zentrifugationszeit, der Zentrifugationsgeschwindigkeit und der Reaktionsvariablen PBMC-Dicke alle einen krummlinigen Zusammenhang aufwiesen. Mit zunehmender Zentrifugationszeit nahm die PBMC-Dicke zunächst ab und nahm dann zu. Mit zunehmender Zentrifugationsgeschwindigkeit nahm die PBMC-Dicke zu Dicke Die Dicke nimmt zunächst zu und dann ab, was darauf hindeutet, dass der Einfluss von Faktorvariablen, nämlich Zentrifugationszeit und -geschwindigkeit, auf die Dicke von PBMC komplex ist und keine einfache lineare Korrelation darstellt, die während des Experiments Beachtung verdient.
Diese Studie verwendete zur Verifizierung die vom Faktorprofiler simulierte und berechnete optimale Zentrifugationszeit und Zentrifugationsgeschwindigkeit und stellte fest, dass die tatsächliche Dicke von PBMC innerhalb des vorhergesagten Dickenbereichs lag, was darauf hinweist, dass das Modell gut passt. Die Trypanblau-Färbung zeigte, dass durch Zentrifugation unter optimalen Bedingungen gewonnene Zellen eine höhere Überlebensrate aufweisen und für nachfolgende experimentelle Forschungen verwendet werden können. Diese Studie stellt eine neue Methode zur Optimierung der Zentrifugationsbedingungen für periphere Blut-PBMC bei Magenkrebspatienten bereit.
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