위암은 암 사망의 흔한 원인이며, 우리나라에서는 그 발생률이 여전히 높아 사람들의 건강을 심각하게 위협하고 있습니다(Zheng Ying and Wu Chunxiao, 2016). 말초혈액단핵세포(PBMC)는 위암의 생존 예후와 밀접한 관련이 있습니다(Tsai et al., 2013), PBMC는 면역 기능을 가지고 있으며(Lv Qiuju et al., 2015), 임상적, 생물학적 연구 가치가 크다(Kim et al., 2016), 종양 치료 연구에 널리 사용됨(Koeck et al., 2016). 그러나 말초정맥혈로부터 PBMC를 분리하기 위한 조건에 대해서는 합의가 이루어지지 않았다(Moreli et al., 2016; Corkum et al., 2015; Dai Guangming et al., 2014), 이에 대한 심층적인 연구가 시급히 필요하다.
JMP 소프트웨어를 기반으로 한 실험 설계는 오류를 효과적으로 제어한다는 전제하에 더 적은 수의 실험으로 신뢰할 수 있는 결과를 얻을 수 있습니다(Wu Fan et al., 2016). 본 연구에서는 JMP 소프트웨어를 사용하여 PBMC의 분리 조건을 맞춤화하고 원심분리 시간과 속도를 최적화함으로써 위암 환자의 PBMC 분리에 대한 최적화, 기초 및 임상 연구의 기초를 제공합니다.
재료 및 방법
본 실험에 사용된 정맥혈은 안후이의과대학교 제1부속병원 위장외과에서 위암 환자로부터 채취한 것입니다.
위암 환자의 말초정맥혈에서 PBMC를 분리하는데 있어서 림프구 분리액의 효율성을 연구하고, 원심분리 후 PBMC 분리층(Y)의 두께에 원심분리 시간(X1)과 원심분리 속도(X2)가 미치는 영향을 관찰한다. 예비 실험 및 문헌 결과를 바탕으로 원심분리 시간 범위는 10~30min, 원심분리 속도 범위는 1000~3000r/min으로 결정되었다. PBMC 분리층의 두께를 반응변수로 사용하였으며, 이를 최대화하는 것을 목표로 설정하였다. 모델에서는 2차 상호작용과 2의 거듭제곱이 선택되었습니다. 요인 제약 조건 정의: 1X1+1X2≤3025, 1X1+1X2≥1020, 맞춤형 PBMC 분리 조건, X1과 X2가 소수를 만나면 정수로 반올림, 총 12개의 실험(아래 표).
PBMC 분리방법
환자의 말초정맥혈 4ml를 EDTA가 함유된 항응고제 튜브에 채취하고, 15ml 원심분리용 튜브에 Ficoll 액위에서 1cm 떨어진 곳에 혈액을 튜브 벽을 따라 Ficoll 액위까지 천천히 추가합니다. 맞춤형 디자인 결과의 변수에 따라 20°C에서 원심분리하고, 원심분리 후 튜브 바닥부터 액체 표면까지 4개의 층, 즉 적혈구 및 과립구 층, 중층 액체 층, 단핵세포층, 플라즈마층.
PBMC 원심력 두께 측정
분리된 원심분리관을 테이프로 수직 벽면에 고정한 후, 디지털 카메라를 PBMC 구름층 수준에 고정한 후 초점을 조정하여 사진을 촬영하였다. 사진을 Photoshop CS 소프트웨어에 넣고 구름 레이어의 두께를 측정합니다. 동일한 시험관 사진의 100mm 눈금의 물리적 길이를 참조로 사용합니다. 눈금자 도구를 사용하여 요소의 길이를 측정합니다. 정보 패널 PBMC의 두께(요소의 길이)를 측정할 때도 동일한 방법을 사용하고, 다음 공식에 따라 PBMC 구름층의 물리적 길이(측정할 두께)를 계산한다.
PBMC 활력 분석
JMP 소프트웨어 분석을 통해 얻은 최적화된 조건에 따라 PBMC를 원심분리한 후 피펫을 구름층에 삽입하고 구름층을 부드럽게 흡입한 후 새 원심분리 튜브에 넣고 PBS에 3배 부피의 PBMC를 20° 추가합니다. C, 2000r, 10min , 2회 세척 후 상청액을 버립니다. PBS 500ul를 첨가하여 희석하여 단일 세포 현탁액을 준비합니다. 위 현탁액 450ul를 EP tube에 피펫팅하고, 트리판블루 용액 50ul를 첨가한 후 세포현탁액과 0.4% 트리판블루 용액을 9:1(최종농도 0.04%)로 혼합한다. 3분 이내에 사진을 찍고 PS 소프트웨어를 사용하여 살아있는 세포와 죽은 세포를 수동으로 표시하고 계산합니다. 현미경으로 관찰하면 죽은 세포는 파란색으로 염색되는 반면, 살아있는 세포는 염색을 거부하여 무색 투명하게 보입니다. 세포 생존율 계산: 세포 생존율(%) = 총 살아있는 세포 수/(총 살아있는 세포 수 + 총 죽은 세포 수) × 100%.
JMP 소프트웨어는 맞춤형 설계 결과 데이터를 분석하고 표준 최소제곱법을 사용하여 원심분리 시간과 원심분리 속도의 주효과, 2차 효과, 상호작용을 분석합니다. 피 ＜ 0.05 그 차이는 통계적으로 유의미합니다.
결과 및 분석
PBMC 두께 측정 결과
JMP custom design을 이용하여 12개의 실험을 얻었으며, 각 실험의 구체적인 원심분리 시간과 원심분리 속도 변수에 따라 원심분리를 수행하였고, 원심분리 후 사진을 촬영하였으며, 원심분리관 내 PBMC의 두께를 측정하기 위해 Photoshop 소프트웨어를 사용하였다. 결과는 표 1에 나와 있습니다.
표 1 다양한 원심분리 조건에서의 PBMC 두께 측정 결과
원심분리 시간 및 원심분리 속도 PBMC 두께의 영향
모델을 맞추기 위해 JMP 소프트웨어를 사용하였고, 효과를 선별하기 위해 표준 최소 자승법을 사용하였으며, 원심분리 시간과 속도라는 두 요인의 주효과, 이차 효과 및 상호 작용이 PBMC의 두께에 영향을 미쳤습니다(표 2).
풀 사이즈 테이블
원심분리 시간, 원심분리 속도 및 이들의 상호작용이 PBMC 두께에 미치는 영향은 모두 통계적으로 유의하였고(P<0.05), 시간과 속도 사이의 상호작용은 통계적으로 유의하지 않았습니다(P>0.05). 각 매개변수의 추정값에 대한 소프트웨어 순위(표 3)에 따르면 원심분리 속도보다 원심분리 시간의 영향이 더 큽니다.
표 3 정렬 후 매개변수 추정치
모델핏
표준최소제곱법을 적용한 모형의 변동분석(표 4) 모형의 평균제곱과 오차는 각각 0.191981과 0.021543 F값은 8.911 모형의 P는 <0.01로 적합함을 나타냄 모델은 α=0.01 수준으로 유의미합니다.
표 4 맞춤형 실험 설계 모델의 변형 분석
피팅 모델(그림 1)에서 예측 값과 실제 값 사이의 관계를 볼 수 있습니다. 결정 계수 R2=0.88은 모델이 변동의 88%를 설명할 수 있고 모델이 잘 적합함을 나타냅니다.
그림 1 예측값과 실제값의 관계
표면 도면
모델은 표준 최소제곱법에 따라 피팅되었으며 JMP 소프트웨어를 사용하여 요인 특성화(표면 프로파일러)를 수행했으며 반응 변수가 있는 모델을 표면으로 표시하여 표면 플롯을 얻었습니다(그림 2). 반응변수의 최대값, 즉 PBMC 두께를 직관적으로 알 수 있으며, 원심분리 시간과 원심분리 속도의 상호작용을 관찰할 수 있습니다.
그림 2 PBMC 두께에 영향을 미치는 원심분리 시간과 속도 사이의 상호 작용에 대한 표면 플롯
예측 프로파일러 최적 설정
JMP 소프트웨어의 예측 프로파일러에서 Maximize Willingness를 선택하면 소프트웨어가 자동으로 예측 프로파일 그래프를 조정하여 최대 PBMC 두께에 대한 최적의 설정을 얻습니다(그림 3). 밀도 구배 원심분리는 PBMC를 PBMC에서 분리하는 데 사용된 것으로 나타났습니다. 위암 환자의 말초혈액을 채취하여 PBMC의 최대 두께를 구하는 방법은 원심분리 시간은 10분, 원심분리 속도는 2306.962r/min으로 설정하여 약 2307r/min으로 설정하였다. 본 실험에서는 위의 조건에서 PBMC 두께의 이론값은 2.596923mm, 95%CI(2.34213, 2.85171)로 예측되었다.
그림 3 의지를 극대화하기 위한 예측 프로파일러 설정
최적화된 조건에서 세포 생존력 분석
원심분리 시간 = 10분, 원심분리 속도 = 2307 r/min, 원심분리로 얻은 PBMC를 트리판 블루로 염색했습니다(그림4). 총 세포 수는 199개, 죽은 세포 수는 총 8개였으며, 세포 생존율은 95%였다.
그림 4 PBMC 트리판 블루 염색(×10)
논의하다
밀도 구배 원심분리는 PBMC를 분리하는 데 널리 사용되지만(Zhao Jie et al., 2014), 단위와 연구자마다 PBMC를 분리하기 위해 서로 다른 원심분리 시간과 원심분리 속도를 사용하며, 분리 효과에 대한 문헌 보고는 거의 없습니다(Huang et al., 2014; Saidijam et al., 2014), 표준 작업 절차 및 지침이 부족하여 실험 결과의 일관성과 비교 가능성이 부족하고 일부 원심 분리의 효율성이 낮아 후속 실험 수행에 영향을 미쳤습니다.
본 연구에서는 맞춤형 설계를 위해 JMP 소프트웨어를 사용하여 PBMC 원심두께를 반응변수로, 원심분리 시간과 원심분리 속도를 요인변수로 하여 12개의 실험을 수행하였다. 원심분리 시간, 원심분리 속도 및 부차적 영향의 주효과는 모두 PBMC의 두께에 영향을 미치며, 원심분리 시간과 원심분리 속도의 상호작용은 통계적으로 유의하지 않은 것으로 나타났다.
확립된 모형의 결정계수 R2=0.88은 반응 변동의 88%를 설명할 수 있습니다. 예측된 PBMC 두께는 실제 값과 잘 일치합니다. 예측 및 특성화를 통해 얻은 최적 분리 조건: 원심분리 시간 = 10min, 원심분리 속도 = 2307r/min, 예상 PBMC 두께 = 2.596923mm, 95%CI(2.34213, 2.85171), 실제 두께 = 2.7mm, 트리판 블루 염색으로 세포 발견 생존 비율 = 95%.
원심분리 시간과 원심분리 속도의 2차 효과는 실험 작업 중에 실질적인 의미가 없습니다. 본 연구에서 발견된 최적 조건은 Cai Minmin et al.(Cai Minmin et al., 2016)의 보고와 일치하지 않으며, 그 주된 이유는 다음과 같다.
- 설계 방식이 다릅니다. Cai Minmin 등은 그룹 실험 설계만 사용했습니다. 본 연구에서는 JMP 소프트웨어를 사용하여 맞춤형 실험 설계를 구현했습니다. 이 설계 방법은 수학적 모델을 기반으로 하며 통계 결과가 보다 과학적이고 진보적입니다(Shi Zhijia et al. al., 2010);
- 연구 대상에는 일정한 차이가 있습니다.
- 온도와 같은 다른 실험 조건에는 특정 차이가 있을 수 있습니다.
- 원심분리기 등 실험 장비의 브랜드에는 차이가 있습니다.
예측 프로파일러 분석 결과, 원심분리 시간, 원심분리 속도, 반응변수 PBMC 두께의 주요 효과는 모두 곡선 관계를 보였으며, 원심분리 시간이 증가함에 따라 PBMC 두께가 먼저 감소하다가 증가했으며, 원심분리 속도가 증가할수록 PBMC 두께는 증가하는 것으로 나타났다. 두께 두께가 처음에는 증가했다가 감소합니다. 이는 요인 변수, 즉 원심분리 시간 및 속도가 PBMC의 두께에 미치는 영향이 복잡하고 단순한 선형 상관관계가 아니므로 실험 중에 주의를 기울일 가치가 있음을 나타냅니다.
본 연구에서는 Factor Profiler를 통해 시뮬레이션하고 계산한 최적의 원심분리 시간과 원심분리 속도를 검증에 활용하였고, PBMC의 실제 두께가 예측된 두께 범위 내에 들어가는 것을 확인하여 모델이 잘 들어맞는다는 것을 알 수 있었다. 트리판 블루 염색은 최적의 조건에서 원심분리하여 얻은 세포가 더 높은 생존율을 가지며 후속 실험 연구에 사용될 수 있음을 보여주었습니다. 본 연구는 위암 환자의 말초혈액 PBMC에 대한 원심분리 조건의 최적화를 위한 새로운 방법을 제공합니다.
마지막으로 그렇습니다. JMP 맞춤형 디자인 관심있는 친구들을 환영합니다 여기를 클릭하세요 최신 버전의 JMP 15를 무료로 다운로드하여 직접 사용해 보세요.
