Le cancer gastrique est une cause fréquente de décès par cancer, et son taux d'incidence reste élevé dans mon pays, menaçant gravement la santé de la population (Zheng Ying et Wu Chunxiao, 2016). Les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) sont étroitement liées au pronostic de survie du cancer gastrique (Tsai et al., 2013), les PBMC ont une fonction immunitaire (Lv Qiuju et al., 2015) et ont une valeur significative en recherche clinique et biologique (Kim et al., 2016), largement utilisé dans la recherche sur le traitement des tumeurs (Koeck et al., 2016). Cependant, il n'existe pas de consensus sur les conditions d'isolement des PBMC du sang veineux périphérique (Moreli et al., 2016 ; Corkum et coll., 2015 ; Dai Guangming et al., 2014), qui nécessite de toute urgence des recherches approfondies.
La conception expérimentale basée sur le logiciel JMP peut obtenir des résultats fiables avec un plus petit nombre d'expériences dans le cadre d'un contrôle efficace des erreurs (Wu Fan et al., 2016). Cette étude utilise le logiciel JMP pour personnaliser les conditions de séparation des PBMC et optimiser le temps et la vitesse de centrifugation, fournissant ainsi une base pour l'optimisation, la recherche fondamentale et clinique sur la séparation des PBMC chez les patients atteints d'un cancer gastrique.
Matériels et méthodes
Le sang veineux utilisé dans cette expérience a été collecté auprès de patients atteints d'un cancer gastrique au service de chirurgie gastro-intestinale du premier hôpital affilié de l'université médicale d'Anhui.
Étudiez l’efficacité de la solution de séparation des lymphocytes pour séparer les PBMC du sang veineux périphérique des patients atteints d’un cancer gastrique et observez les effets du temps de centrifugation (X1) et de la vitesse de centrifugation (X2) sur l’épaisseur de la couche de séparation des PBMC (Y) après centrifugation. Sur la base des résultats d'expériences préliminaires et de la littérature, il a été déterminé que la plage de temps de centrifugation est de 10 à 30 minutes et la plage de vitesse de centrifugation est de 1 000 à 3 000 tr/min. L'épaisseur de la couche de séparation des PBMC a été utilisée comme variable de réaction et l'objectif a été de la maximiser. Les interactions quadratiques et les puissances de deux ont été sélectionnées dans le modèle. Définir les contraintes factorielles : 1X1+1X2≤3025, 1X1+1X2≥1020, conditions de séparation PBMC conçues sur mesure, arrondies aux nombres entiers lorsque X1 et X2 rencontrent des décimales, un total de 12 expériences (tableau ci-dessous).
PBMC Méthode de séparation
Recueillir 4 ml de sang veineux périphérique du patient dans un tube anticoagulant contenant de l'EDTA. Dans un tube à centrifuger de 15 ml, placer à 1 cm du niveau de liquide Ficoll et ajouter lentement du sang le long de la paroi du tube jusqu'au niveau de liquide Ficoll. Centrifuger à 20°C selon les paramètres des résultats de conception personnalisés. Après centrifugation, il est divisé en quatre couches du fond du tube jusqu'à la surface du liquide, à savoir la couche de globules rouges et de granulocytes, la couche liquide stratifiée, la couche de cellules mononucléées et couche de plasma.
PBMC Mesure d'épaisseur centrifuge
Le tube à centrifuger séparé a été fixé sur la paroi verticale avec du ruban adhésif, a fixé l'appareil photo numérique au niveau de la couche nuageuse de PBMC et a ajusté la mise au point pour prendre des photos. Insérez la photo dans le logiciel Photoshop CS et mesurez l'épaisseur de la couche nuageuse : la longueur physique de l'échelle 100 mm dans la même image de tube à essai est utilisée comme référence. Utilisez l'outil règle pour mesurer la longueur de l'élément. lit les données et les enregistre. La même méthode est utilisée pour mesurer l'épaisseur du PBMC (la longueur de l'élément). ), calculer la longueur physique (épaisseur à mesurer) de la couche nuageuse de PBMC selon la formule suivante :
PBMC Test de vitalité
Selon les conditions optimisées obtenues grâce à l'analyse du logiciel JMP, centrifuger les PBMC. Insérer la pipette dans la couche nuageuse, aspirer délicatement la couche nuageuse, la placer dans un nouveau tube à centrifuger, ajouter 3 fois le volume de PBMC dans du PBS, 20° C, 2000r, 10min, laver deux fois et jeter le surnageant. Ajouter 500ul de PBS à diluer pour préparer une suspension unicellulaire. Pipeter 450ul de la suspension ci-dessus dans le tube EP, ajouter 50ul de solution de bleu trypan et mélanger la suspension cellulaire et la solution de bleu trypan à 0,4% 9:1 (concentration finale 0,04%). Prenez des photos dans les 3 minutes, marquez et comptez manuellement les cellules vivantes et mortes à l'aide du logiciel PS. Observées au microscope, les cellules mortes étaient colorées en bleu, tandis que les cellules vivantes refusaient de se colorer et étaient incolores et transparentes. Calculez le taux de survie cellulaire : Taux de survie cellulaire (%) = nombre total de cellules vivantes/(nombre total de cellules vivantes + nombre total de cellules mortes) × 100 %.
JMP Le logiciel analyse les données de résultats de conception personnalisées et utilise la méthode standard des moindres carrés pour analyser les effets principaux, les effets secondaires et les interactions entre le temps de centrifugation et la vitesse de centrifugation. P. ＜ 0,05 Statistiquement, la différence est significative.
résultats et analyse
PBMC résultats de mesure d'épaisseur
Douze expériences ont été obtenues en utilisant la conception personnalisée JMP. Selon les paramètres spécifiques de temps de centrifugation et de vitesse de centrifugation dans chaque expérience, la centrifugation a été effectuée. Après la centrifugation, des photos ont été prises. Le logiciel Photoshop a été utilisé pour mesurer l'épaisseur des PBMC dans le tube à centrifuger. les résultats sont présentés dans le tableau 1.
Tableau 1 : Résultats des mesures d'épaisseur des PBMC dans différentes conditions de centrifugation
Temps de centrifugation et vitesse de centrifugation PBMC Effet de l'épaisseur
Le logiciel JMP a été utilisé pour ajuster le modèle et la méthode standard des moindres carrés a été utilisée pour filtrer les effets. L'effet principal, l'effet secondaire et l'interaction des deux facteurs de temps et de vitesse de centrifugation ont affecté l'épaisseur des PBMC (Tableau 2).
Tableau 2 Effet des facteurs de séparation centrifuge sur l'épaisseur des PBMC
Les effets du temps de centrifugation, de la vitesse de centrifugation et de leur interaction sur l'épaisseur des PBMC étaient tous statistiquement significatifs, P <0,05 ; l'interaction entre le temps et la vitesse n'était pas statistiquement significative (P > 0,05). D'après le classement logiciel des valeurs estimées de chaque paramètre (tableau 3), l'impact du temps de centrifugation est supérieur à la vitesse de centrifugation.
Tableau 3 Estimations des paramètres après tri
Ajustement du modèle
Analyse de variation du modèle ajusté par la méthode standard des moindres carrés (tableau 4). Les carrés moyens du modèle et l'erreur sont respectivement de 0,191981 et 0,021543. La valeur F est de 8,911. Le P du modèle est <0,01, ce qui indique que l'ajustement Le modèle est au niveau de α=0,01. est significatif.
Tableau 4 Analyse des variations du modèle de conception expérimentale personnalisé
La relation entre la valeur prédite et la valeur réelle dans le modèle d'ajustement (Figure 1) est visible : le coefficient de détermination R2 = 0,88, indiquant que le modèle peut expliquer 88 % de la variation et que le modèle s'ajuste bien.
Figure 1 Relation entre les valeurs prédites et les valeurs réelles
Dessin de surfaces
Le modèle a été ajusté selon la méthode standard des moindres carrés et le logiciel JMP a été utilisé pour effectuer la caractérisation des facteurs (profileur de surface). Le modèle avec les variables de réaction a été affiché sous forme de surface pour obtenir un tracé de surface (Figure 2). La valeur maximale de la variable de réaction, c’est-à-dire l’épaisseur des PBMC, peut être trouvée intuitivement et l’interaction entre le temps de centrifugation et la vitesse de centrifugation peut être observée.
Figure 2 : tracé de surface de l'interaction entre le temps de centrifugation et la vitesse affectant l'épaisseur des PBMC
Paramètres optimaux du profileur de prédiction
Sélectionnez Maximiser la volonté dans le profileur de prédiction du logiciel JMP, et le logiciel ajuste automatiquement le graphique du profil de prédiction pour obtenir le réglage optimal pour l'épaisseur maximale des PBMC (Figure 3). Il a été constaté que la centrifugation sur gradient de densité était utilisée pour séparer les PBMC des sang périphérique de patients atteints d'un cancer gastrique et obtenir l'épaisseur maximale de PBMC.La méthode est la suivante : le temps de centrifugation est de 10 minutes et la vitesse de centrifugation est réglée à 2306,962 tr/min, soit environ 2307 tr/min. Cette expérience prédit que dans les conditions ci-dessus, la valeur théorique de l'épaisseur des PBMC est de 2,596923 mm, 95 % IC (2,34213, 2,85171).
Figure 3 Paramètres du profileur de prédiction pour maximiser la volonté
Test de viabilité cellulaire dans des conditions optimisées
Temps de centrifugation = 10 min, vitesse de centrifugation = 2 307 tr/min et les PBMC obtenues par centrifugation ont été colorées au bleu trypan (Figure 4). Le nombre total de cellules était de 199, le nombre total de cellules mortes était de 8 et le taux de survie cellulaire était de 95 %.
Figure 4 Coloration au bleu trypan des PBMC (×10)
discuter
La centrifugation par gradient de densité est largement utilisée pour séparer les PBMC (Zhao Jie et al., 2014), mais différentes unités et chercheurs utilisent différents temps et vitesses de centrifugation pour séparer les PBMC, et il existe peu de rapports publiés sur les effets de séparation (Huang et al., 2014 ; Saidijam et al., 2014), l'absence de procédures opérationnelles et de lignes directrices standard a entraîné un manque de cohérence et de comparabilité des résultats expérimentaux, ainsi qu'une faible efficacité de certaines séparations centrifuges, ce qui a affecté la conduite des expériences ultérieures.
Cette étude a utilisé le logiciel JMP pour une conception personnalisée, en utilisant l'épaisseur centrifuge des PBMC comme variable de réaction, le temps de centrifugation et la vitesse de centrifugation comme variables factorielles, et a obtenu 12 expériences. L'épaisseur des PBMC centrifugées a été mesurée à l'aide de Photoshop CS6.0 et analysée par les moindres carrés standard. Il a été constaté que : les effets principaux du temps de centrifugation, de la vitesse de centrifugation et leurs effets secondaires affectaient tous l'épaisseur des PBMC ; l'interaction entre le temps de centrifugation et la vitesse de centrifugation n'était pas statistiquement significative.
Le coefficient de détermination R2=0,88 du modèle établi peut expliquer 88% de la variation des réponses. L’épaisseur prévue des PBMC est en bon accord avec la valeur réelle. Les conditions de séparation optimales obtenues par prédiction et caractérisation : temps de centrifugation = 10 min, vitesse de centrifugation = 2 307 tr/min, épaisseur prévue des PBMC = 2,596923 mm, 95 % IC (2,34213, 2,85171), épaisseur réelle = 2,7 mm, coloration au bleu trypan des cellules trouvées. Survie taux = 95%.
Les effets secondaires du temps de centrifugation et de la vitesse de centrifugation n’ont aucune signification pratique lors des opérations expérimentales. Les conditions optimales trouvées dans cette étude ne correspondent pas au rapport de Cai Minmin et al. (Cai Minmin et al., 2016), pour les principales raisons :
- Le schéma de conception est différent. Cai Minmin et al. ont utilisé uniquement un plan expérimental de groupe. Cette étude a utilisé le logiciel JMP pour mettre en œuvre un plan expérimental personnalisé. Cette méthode de conception est basée sur des modèles mathématiques et les résultats statistiques sont plus scientifiques et avancés (Shi Zhijia et al., 2010);
- Il existe certaines différences dans les objets de recherche ;
- Il peut y avoir certaines différences dans d'autres conditions expérimentales telles que la température ;
- Il existe des différences selon les marques d'équipements expérimentaux tels que les centrifugeuses.
L'analyse prédictive du profileur a révélé que les principaux effets du temps de centrifugation, de la vitesse de centrifugation et de l'épaisseur variable des PBMC de réaction montraient tous une relation curviligne. À mesure que le temps de centrifugation augmentait, l'épaisseur des PBMC diminuait d'abord, puis augmentait. À mesure que la vitesse de centrifugation augmentait, les PBMC épaisseur L'épaisseur augmente d'abord puis diminue, indiquant que l'influence des variables factorielles, à savoir le temps et la vitesse de centrifugation, sur l'épaisseur des PBMC est complexe et non une simple corrélation linéaire, qui mérite attention au cours de l'expérience.
Cette étude a utilisé le temps et la vitesse de centrifugation optimaux simulés et calculés par le profileur de facteurs à des fins de vérification et a révélé que l'épaisseur réelle des PBMC se situait dans la plage d'épaisseur prévue, ce qui indique que le modèle s'ajustait bien. La coloration au bleu trypan a montré que les cellules obtenues par centrifugation dans des conditions optimales ont un taux de survie plus élevé et peuvent être utilisées pour des recherches expérimentales ultérieures. Cette étude fournit une nouvelle méthode pour l’optimisation des conditions de centrifugation des PBMC du sang périphérique chez les patients atteints d’un cancer gastrique.
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