胃がんはがんによる死亡の一般的な原因であり、我が国ではその発生率が依然として高く、人々の健康を深刻に脅かしています(Zheng Ying and Wu Chunxiao、2016)。末梢血単核球 (PBMC) は胃癌の生存予後と密接に関連しています (Tsai et al., 2013)、PBMC には免疫機能があり (Lv Qiuju et al., 2015)、重要な臨床的および生物学的研究価値があります (Kim et al., 2016)、腫瘍治療研究で広く使用されています (Koeck et al.、 2016）。しかし、末梢静脈血から PBMC を分離するための条件についてはコンセンサスがありません (Moreli et al., 2016; Corkum et al.、 2015;Dai Guangming et al., 2014)、早急に詳細な研究が必要です。
JMP ソフトウェアに基づく実験計画は、誤差を効果的に制御するという前提の下で、より少ない実験数で信頼性の高い結果を得ることができます (Wu Fan et al., 2016)。この研究では、JMP ソフトウェアを使用して PBMC の分離条件をカスタマイズし、遠心分離の時間と速度を最適化し、胃がん患者における PBMC 分離の最適化、基礎および臨床研究の基礎を提供します。
材料と方法
この実験で使用された静脈血は、安徽医科大学第一付属病院消化器外科の胃がん患者から採取されたものです。
胃がん患者の末梢静脈血から PBMC を分離する際のリンパ球分離溶液の効率を研究し、遠心分離後の PBMC 分離層 (Y) の厚さに及ぼす遠心分離時間 (X1) と遠心分離速度 (X2) の影響を観察します。予備実験の結果と文献に基づいて、遠心分離時間の範囲は10〜30min、遠心分離速度の範囲は1000〜3000r/minであることが決定されました。 PBMC 分離層の厚さを反応変数として使用し、目標を最大化するように設定しました。モデルでは二次相互作用と 2 の累乗が選択されました。因子制約を定義します: 1X1+1X2≤3025、1X1+1X2≥1020、カスタム設計の PBMC 分離条件、X1 と X2 が小数に遭遇した場合は整数に切り上げ、合計 12 回の実験 (下表)。
PBMC分離方法
患者の末梢静脈血 4 ml を EDTA の入った抗凝固剤チューブに採取し、15 ml 遠心管にフィコール液面から 1 cm 離し、チューブ壁に沿ってゆっくりと血液をフィコール液面まで加えます。カスタマイズされた設計結果のパラメータに従って 20°C で遠心分離し、遠心分離後、チューブの底から液面まで、赤血球および顆粒球層、層状液体層、液体層の 4 つの層に分割します。単核球層と血漿層です。
PBMC遠心力厚さ測定
分離した遠心分離管をテープで垂直壁に固定し、PBMC 雲層のレベルにデジタル カメラを固定し、焦点を調整して写真を撮影しました。写真を Photoshop CS ソフトウェアに入力し、雲層の厚さを測定します。同じ試験管の写真にある 100 mm スケールの物理的な長さを基準として使用します。要素の長さを測定するには、定規ツールを使用します。情報パネルデータを読み取って記録します。PBMC の厚さ (要素の長さ) の測定にも同じ方法が使用されます。)、次の式に従って PBMC 雲層の物理的な長さ (測定される厚さ) を計算します。
PBMCバイタリティアッセイ
JMP ソフトウェア分析によると、最適な条件が得られました PBMC を遠心分離し、ピペットを雲層に挿入し、静かに雲層を吸い出し、新しい遠沈管に置き、PBS に 3 倍量の PBMC を加え、 20℃、2000r、10分間、2回洗浄し、上清を捨てます。 500μlのPBSを加えて希釈し、単一細胞懸濁液を調製します。上記懸濁液４５０μｌをピペットでＥＰチューブに移し、５０μｌのトリパンブルー溶液を加え、細胞懸濁液と０．４％トリパンブルー溶液を９：１（最終濃度０．０４％）で混合する。 3 分以内に写真を撮り、PS ソフトウェアを使用して生細胞と死細胞を手動でマークして数えます。顕微鏡で観察すると、死んだ細胞は青色に染色されますが、生きた細胞は染色されず、無色透明に見えます。細胞生存率の計算: 細胞生存率 (%) = 生細胞の総数/(生細胞の総数 + 死細胞の総数) × 100%。
JMPソフトウェアはカスタマイズされた設計結果データを分析し、標準の最小二乗法を使用して主効果、副次効果、および遠心分離時間と遠心分離速度の相互作用を分析します。 P ＜ 0.05この差は統計的に有意です。
結果と分析
PBMC厚み測定結果
JMP カスタム設計を使用して 12 の実験が得られました。各実験の特定の遠心分離時間と遠心分離速度パラメーターに従って、遠心分離が実行されました。遠心分離後、写真が撮影されました。Photoshop ソフトウェアを使用して、遠心分離管内の PBMC の厚さを測定しました。結果を表 1 に示します。
表 1 さまざまな遠心分離条件での PBMC の厚さの測定結果
遠心時間と遠心速度PBMC厚さの影響
JMP ソフトウェアを使用してモデルをフィッティングし、標準的な最小二乗法を使用して効果をスクリーニングしたところ、主効果、二次効果、および遠心時間と速度の 2 つの要素の相互作用が PBMC の厚さに影響を及ぼしました (表 2)。
表 2 PBMC の厚さに及ぼす遠心分離係数の影響
遠心分離時間、遠心分離速度、およびそれらの相互作用が PBMC の厚さに及ぼす影響はすべて統計的に有意であり (P<0.05)、時間と速度の相互作用は統計的に有意ではありませんでした (P>0.05)。各パラメーターの推定値のソフトウェアランキング (表 3) によると、遠心分離速度よりも遠心分離時間の影響が大きくなります。
表 3 ソート後のパラメータ推定値
モデルの適合
標準最小二乗法によるモデルの変動分析 (表 4)。モデルの平均二乗と誤差は、それぞれ 0.191981 と 0.021543 です。F 値は 8.911 です。モデルの P は <0.01 であり、適合されていることを示しています。モデルは α=0.01 のレベルにあり、有意です。
表 4 カスタマイズされた実験計画モデルの変動分析
フィッティング モデル (図 1) における予測値と実際の値の関係がわかります。決定係数 R2=0.88 は、モデルが変動の 88% を説明でき、モデルがよく適合していることを示しています。
図1 予測値と実績値の関係
表面図
モデルは標準的な最小二乗法に従ってフィッティングされ、JMP ソフトウェアを使用して因子特性評価 (表面プロファイラー) が実行され、反応変数を含むモデルが表面として表示され、表面プロットが得られました (図 2)。反応変数の最大値、つまり PBMC の厚さを直感的に見つけることができ、遠心分離時間と遠心分離速度の相互作用を観察できます。
図 2 PBMC の厚さに影響する遠心分離時間と速度の相互作用の表面プロット
予測プロファイラーの最適設定
JMP ソフトウェアの予測プロファイラーで [Maximize Willingness] を選択すると、ソフトウェアは予測プロファイル グラフを自動的に調整して、PBMC の最大厚さの最適な設定を取得します (図 3)。胃がん患者の末梢血を採取し、PBMCの最大厚さを求める方法は、遠心時間10分、遠心速度2306.962r/min、つまり約2307r/minである。この実験は、上記の条件下で、PBMC の厚さの理論値は 2.596923mm、95%CI (2.34213、2.85171) であると予測します。
図 3 意欲を最大化するための予測プロファイラーの設定
最適化された条件下での細胞生存率アッセイ
遠心時間 = 10 分、遠心速度 = 2307 r/min、遠心分離によって得られた PBMC をトリパン ブルーで染色しました (図 4)。総細胞数は１９９個、死細胞総数は８個、細胞生存率は９５％であった。
図4 PBMCトリパンブルー染色（×10）
話し合う
密度勾配遠心分離は PBMC の分離に広く使用されていますが (Zhao Jie et al., 2014)、ユニットや研究者によって PBMC の分離に異なる遠心時間と遠心分離速度が使用されており、分離効果に関する文献報告はほとんどありません (Huang et al., 2014)。 2014; Saidijam et al.、 2014 年）、標準的な操作手順とガイドラインの欠如により、実験結果の一貫性と比較可能性が欠如し、一部の遠心分離の効率が低下し、その後の実験の実施に影響を及ぼしました。
この研究では、JMP ソフトウェアを使用してカスタマイズされた設計を行い、PBMC の遠心厚さを反応変数として、遠心分離時間と遠心分離速度を因子変数として使用し、12 回の実験を取得しました。遠心分離された PBMC の厚さは、Photoshop CS6.0 を使用して測定され、標準最小二乗法によって分析されました。遠心分離時間、遠心分離速度、およびそれらの二次効果のすべてが PBMC の厚さに影響を及ぼし、遠心分離時間と遠心分離速度の間の相互作用は統計的に有意ではないことが判明しました。
確立されたモデルの決定係数 R2=0.88 は、応答変動の 88% を説明できます。予測された PBMC の厚さは実際の値とよく一致しています。予測と特性評価によって得られた最適な分離条件: 遠心分離時間 = 10 分、遠心分離速度 = 2307r/min、予測 PBMC 厚さ = 2.596923mm、95%CI (2.34213、2.85171)、実際の厚さ = 2.7mm、トリパン ブルー染色で細胞生存が確認されました。率 = 95%。
遠心分離時間と遠心分離速度の二次的な影響は、実験操作中には実際的な意味を持ちません。この研究で見つかった最適条件は、Cai Minmin らの報告 (Cai Minmin et al., 2016) と矛盾しています。主な理由は次のとおりです。
- 設計スキームは異なります。Cai Minmin らはグループ実験計画のみを使用しました。この研究では、カスタマイズされた実験計画を実装するために JMP ソフトウェアを使用しました。この計画方法は数学的モデルに基づいており、統計結果はより科学的で高度です (Shi Zhijia et al.) al.、2010)。
- 研究対象には特定の違いがあります。
- 温度などの他の実験条件では特定の違いが生じる可能性があります。
- 遠心分離機などの実験機器はメーカーによって違いがあります。
予測プロファイラー分析により、遠心分離時間、遠心分離速度、および反応変数 PBMC 厚さの主効果はすべて曲線関係を示すことがわかりました。遠心分離時間が増加するにつれて、PBMC 厚さは最初に減少し、その後増加しました。遠心分離速度が増加するにつれて、PBMC の厚さは曲線関係を示しました。厚さ 厚さは最初に増加し、その後減少します。これは、因子変数、つまり遠心分離時間と速度が PBMC の厚さに及ぼす影響が単純な線形相関ではなく複雑であることを示しており、これは実験中に注目に値します。
この研究では、検証のためにファクタープロファイラーによってシミュレーションおよび計算された最適な遠心分離時間と遠心分離速度を使用しました。その結果、PBMC の実際の厚さが予測された厚さの範囲内に収まることがわかり、モデルがよく適合していることがわかりました。トリパンブルー染色により、最適な条件下で遠心分離して得られた細胞は生存率が高く、その後の実験研究に使用できることが示されました。この研究は、胃癌患者の末梢血 PBMC の遠心分離条件を最適化するための新しい方法を提供します。
最後に、はいJMPカスタマイズされたデザイン興味のあるお友達は大歓迎ですここをクリック最新バージョンの JMP 15 を無料でダウンロードして、実際に試してみてください。
