Configuración de diseños de placas de 96 y 384 pocillos con réplicasHola científicos del JMP,
Estoy trabajando en algunos proyectos de desarrollo de ensayos basados en células en los que uso DOE para intentar optimizar los parámetros que puedo controlar en los experimentos.
Configurar los diseños para placas de 96 y 384 pocillos para obtener un nivel razonable de replicación y evitar efectos de borde es una especie de molestia. ¿Existen algunas buenas estrategias que no impliquen aleatorizar todo el plato con un robot? (aunque tengo un controlador líquido para ciertas variables que son más susceptibles a la aleatorización) Qué tipos de diseños y qué términos (por ejemplo, interacciones, cuadráticos, cúbicos...) ¿Estás poniendo en los diseños? ¿Cómo se manejan las 'réplicas' en el generador de diseño personalizado del DOE? Tengo curiosidad por recibir la mayor cantidad de comentarios posible. Entiendo el poder y la utilidad del DOE, soy un converso, pero solo necesito ayuda para finalmente hacer despegar este esfuerzo y utilizarlo en nuestro desarrollo de ensayos y diseño experimental diario.
¡Gracias!
Diseño de experimentosRe: Un llamado a los científicos del JMPEntonces, esto agrega un poco más de complejidad. Una solución práctica a considerar es repetir el mismo diseño de placas para fármaco, tampón y suero, con diferentes placas de concentración celular. Luego, para abordar los tiempos de incubación, podría preparar varias placas en cada una de las concentraciones celulares para poder extraer las placas en los momentos adecuados.
Por supuesto, la concentración de la celda. deberá tener al menos tres niveles para admitir un término de modelo cuadrático.
El tiempo se maneja de manera diferente. Podría analizar cada punto de tiempo por separado Y ajustaría una curva (Ajustar curva) a la respuesta frente al tiempo, fuera del análisis DOE. Luego, los parámetros de la curva (como pendiente, asíntota, punto de inflexión/EC50) se convertirían en respuestas en la tabla DOE. Si aún no hay una publicación sobre parametrización de datos de series temporales, entonces ese sería un buen tema para alguien (o para mí) más adelante.
Esto puede convertirse en un experimento bastante grande, pero para eso están los robots pipeteadores.
Para la pregunta extra. Espero que el cambio en tramas completas y subtramas tenga poco o ningún efecto con tan pocos factores. Pero como todo, verifica primero. Realice ambos diseños y luego utilice la herramienta de comparación de diseños (DOE/Diagnóstico de diseño).
Re: Un llamado a los científicos del JMP¡Gracias por el aporte tan útil!
Usando esto, creé un diseño que se vería así:
PlateLayout.PNG
Ahora, es posible variar la densidad celular en una placa, pero es bastante tedioso porque el pipeteo de las células con un manipulador de líquidos debe realizarse con cuidado. En resumen: me gustaría variar la densidad celular entre placas pero no entre pocillos. Otro factor sería variar el tiempo de incubación (no se muestra aquí), que también se puede variar sólo entre placas y no entre pocillos. Mi enfoque sería utilizar los dos factores "ficticios" como verdaderos, es decir, el tiempo de incubación y la densidad celular, pero eso no da el resultado correcto.Luego, también necesitaría incluir estos factores en mi modelo, incluida la interacción y los términos cuadráticos. ¿Dónde está mi error? ¿O cómo debería abordar esto?
Y pregunta extra:
Si quiero omitir los pozos de borde para evitar el efecto de borde, ¿establecería el número de parcelas completas en 6 y las subtramas en 10?
¡Gracias de antemano!
Re: Un llamado a los científicos del JMPConstruyendo 96 experimentos de pozos.
Screen Shot 2017-09-12 at 5.09.17 PM.png
Eche un vistazo a este método de construcción del DOE. Hay 4 factores continuos y 2 factores continuos adicionales para usar como variables ficticias para las configuraciones difíciles y muy difíciles de cambiar. (variables ficticias para construir el todo y las subtramas). Los factores X3, X4, X5 y X6 son los factos experimentales, el diseño incluye términos de interacción y modelo cuadrático para cada uno de ellos. Factores X1 y
X2 son efectos principales que están configurados como difíciles y muy difíciles de cambiar.
(Traducido de Stat Speak: Si tiene un robot que puede pipetear un diseño de placa aleatorio, sería conveniente si su mesa DOE también tuviera ubicaciones de placa. En este ejemplo, voy a forzar a JMP a que me proporcione posiciones de placas que se etiquetarán como "Subtrama" y "Trama completa". Para que esto funcione, los primeros dos factores/variables/entradas/X que agrego serán simplemente ficticios. Haga que la primera X ficticia sea difícil de cambiar y que la segunda X sea muy difícil de cambiar. Desde aquí agregue sus otras variables como fármaco, inhibidor, tampón, cofactor, nutriente, fuente de carbono o lo que le interese estudiar. Luego, como de costumbre, agregue los términos, como interacciones y cuadráticas, al modelo. Tenga mucho cuidado de no incluir las X ficticias en las interacciones y términos cuadráticos. Todo lo que necesitamos son los efectos principales.
Este último paso es fundamental para que esto funcione, no lo omita. Existe una opción: "Los factores difíciles de cambiar pueden variar independientemente de los factores muy difíciles de cambiar". Esto DEBE comprobarse. Eche un vistazo al guión y notará esto: "Hacer un diseño de trama de tira", en el argumento. Activar esta opción hace que ese bit aparezca en el script. (Las estadísticas hablan: JMP puede crear diseños de tramas en franjas con restricciones de aleatorización para tramas completas y secundarias que sean independientes entre sí). La siguiente parte también es importante. Establezca el número de gráficos completos y subgráficos, y luego el número de ejecuciones. Una de las parcelas debe ser 8 y la otra debe ser 12, y el número de ejecuciones es 64. En el pasado, solo tenía 8 columnas reservadas para el experimento y luego usaba las últimas tres para controles y curvas estándar. En este caso, las tramas completas y las subtramas son 8 y las corridas = 64. Después de crear la tabla de diseño, no debería ser demasiado difícil pasar el diseño a su robot para que lo pipetee).
Screen Shot 2017-09-12 at 5.14.56 PM.png
En el diseño generado, JMP proporciona 8 parcelas completas y 12 subparcelas en dos columnas que pueden usarse como la ubicación de cada uno de los 96 pozos. En la siguiente figura, X3, X4, X5 y X6 no tienen restricciones de aleatorización y es evidente un patrón diferente para cada variable, representada como cuatro de las cuatro cuadrículas.
Una vez finalizado el experimento, será importante recordar no incluir las dos variables ficticias en el modelo. De forma predeterminada, estos estarán en el script del modelo.
Guión de diseño
DOE(
Custom Design,
{Add Response( Maximize, "Y", ., ., . ),
Add Factor( Continuous, -1, 1, "whole plot dummy", 1 ),
Add Factor( Continuous, -1, 1, "sub plot dummy", 2 ),
Add Factor( Continuous, -1, 1, "X3", 0 ),
Add Factor( Continuous, -1, 1, "X4", 0 ),
Add Factor( Continuous, -1, 1, "X5", 0 ),
Add Factor( Continuous, -1, 1, "X6", 0 ), Set Random Seed( 42 ),
Number of Starts( 10 ), Add Term( {1, 0} ), Add Term( {1, 1} ),
Add Term( {2, 1} ), Add Term( {3, 1} ), Add Term( {4, 1} ), Add Term( {5, 1} ),
Add Term( {6, 1} ), Add Term( {3, 1}, {4, 1} ), Add Term( {3, 1}, {5, 1} ),
Add Term( {3, 1}, {6, 1} ), Add Term( {4, 1}, {5, 1} ),
Add Term( {4, 1}, {6, 1} ), Add Term( {5, 1}, {6, 1} ), Add Term( {3, 2} ),
Add Term( {4, 2} ), Add Term( {5, 2} ), Add Term( {6, 2} ),
Make Strip Plot Design, Set N Whole Plots( 8 ), Set N Subplots( 12 ),
Set Sample Size( 96 ), Optimality Criterion( 2 ), Make Design}
);
Re: Un llamado a los científicos del JMPParte de la desgana aquí podría deberse al lenguaje que utilizamos. Quizás eso debería haber sido idiomas . El científico habla de placas y pocillos, pipeteo y dilución, tiempo de incubación, concentración, etc. El estadístico, por otro lado, (indirectamente a través de la interfaz de usuario de JMP para diseño personalizado y directamente a través de las respuestas aquí) habla sobre tipos de factores, niveles de factores fáciles, difíciles o muy difíciles de cambiar, gráficos completos y subgráficos, bloqueos. , etcétera.
¿Conseguiste todo eso? Probablemente no. Eso es normal.
Por eso debemos tomarnos el tiempo para explicarnos a las demás personas en la discusión. Cuanto más avanzados sean el tema y las cuestiones, más explicaciones se necesitarán para comunicar plenamente el problema y la solución.
Re: Un llamado a los científicos del JMPCreo que esta cuestión de diseñar un experimento sofisticado con restricciones a la aleatorización es importante y, por lo tanto, esta discusión podría ayudar a muchos usuarios en una situación similar. Es un gran ejemplo de lo que esperábamos que esta área de discusión en la comunidad JMP pudiera ser para todos nosotros. Me desconcierta que no haya habido actividad durante una semana. Dudo que sea porque la última respuesta respondió a todas las preguntas restantes.
Espero que la discusión se reanude. Aquí hay algunos puntos que espero provoquen más respuestas:
- ¿En qué se parece este caso al suyo si desarrolla ensayos? ¿Cómo es diferente?
- ¿Tiene las mismas restricciones para aleatorizar las ejecuciones (pozos)? ¿Más? ¿Menos? ¿Sólo diferente?
- Las restricciones a la aleatorización impactan claramente en qué tan práctico es ejecutar el diseño. ¿Está igualmente claro cómo la restricción afecta el análisis? ¿Qué podría pasar con mi interpretación del modelo de regresión si se ignora la restricción en el análisis?
- ¿Cuáles son algunas prácticas que le resultan beneficiosas al diseñar, ejecutar o analizar un experimento con restricciones?
(Tenga en cuenta que hay otra discusión relacionada iniciada por el mismo usuario. ¡Voy a publicar este llamado a la acción y que gane la mejor discusión!)
Re: Un llamado a los científicos del JMPHe estado al acecho en esta pregunta porque estoy seguro de que probablemente haya algunas opiniones sólidas sobre este tema. A continuación se muestra una forma de configurar un experimento de 96 pozos.
Este diseño hace algunas cosas que creo que son útiles.
En el experimento hay factores continuos:
1. Fármaco, un inhibidor que me interesa estudiar
2. Stim, la cosa estimula una respuesta que se supone que la droga inhibe.
3. Nivel sérico, las células crecen mejor pero aumentan el fondo de la respuesta.
y algunos factores categóricos:
1. Tipo de medio
2. Línea celular, línea celular diferente para cada placa.
Para que la configuración de la placa sea razonable, quiero imponer algunas restricciones a la aleatorización. Si tuviera mucho tiempo, podría programar el robot de pipeteo para aleatorizar completamente toda la placa, pero si solo restringo la aleatorización, puedo mantener las mismas concentraciones en las columnas y en las filas, y el cultivo en placas se vuelve mucho más simple.
En primer lugar, para el alcance de esto, básicamente tengo 384 pocillos con los que trabajar, 96 por placa y 4 placas (una para cada línea celular). Para los factores con los que estoy trabajando, puedo mirar fácilmente los de segundo orden. interacciones y efectos cuadráticos para los términos continuos. Cuando configuro los platos, tengo 12 columnas y 32 filas (8 filas para cada uno de los 4 platos).
En el cuadro de diálogo DOE, restringiré la aleatorización de filas y columnas. Esto significa hacer que algunos factores sean "difíciles" de cambiar y otros "muy difíciles", lo que hace que este sea un experimento de trama dividida. Las tramas completas corresponden a factores difíciles y las subtramas corresponden a factores muy difíciles de cambiar. Entonces, si tengo 12 subtramas y 32 (8x4) tramas completas, entonces las cosas difíciles de cambiar (en este caso, Droga y Suero) serán constantes en las columnas y cada fila individual será la misma en toda la placa. Déjame explicarte esto un poco más. Cada columna tiene una concentración diferente, la concentración es la misma en toda la columna. (Muy útil si estás pipeteando multicanal tus propias placas).
Lo último a considerar es la placa/línea celular. Lo que realmente necesito es una gráfica dividida en tres, por lo que la línea celular/placa sería "muy difícil de cambiar", pero esa no es una opción, y podría ser mejor si hubiera un patrón de subtrama diferente para las columnas de cada placa. pero esto es bastante bueno. (De manera realista, simplemente hacer 8 parcelas completas y 12 subtramas y usar el mismo diseño de placa para cada una de las cuatro líneas celulares probablemente sea suficiente, además reduce las oportunidades de error en el diseño de la placa).
DOE(
Custom Design,
{Add Response( Maximize, "Y", ., ., . ),
Add Factor( Continuous, 2, 25, "Drug", 1 ),
Add Factor( Continuous, 0.02, 0.1, "Serum", 1 ),
Add Factor( Categorical, {"IMDM", "RPMI", "DMEM"}, "Media", 2 ),
Add Factor( Continuous, 5, 50, "Stim", 2 ),
Add Factor( Categorical, {"L1", "L2", "L3", "L4"}, "Plate Number", 2 ),
Set Random Seed( 550796982 ), Number of Starts( 1 ), Add Term( {1, 0} ),
Add Term( {1, 1} ), Add Term( {2, 1} ), Add Term( {3, 1} ), Add Term( {4, 1} ),
Add Term( {5, 1} ), Add Term( {1, 2} ), Add Term( {1, 1}, {2, 1} ),
Add Term( {2, 2} ), Add Term( {1, 1}, {3, 1} ), Add Term( {2, 1}, {3, 1} ),
Add Term( {1, 1}, {4, 1} ), Add Term( {2, 1}, {4, 1} ),
Add Term( {3, 1}, {4, 1} ), Add Term( {4, 2} ), Add Term( {1, 1}, {5, 1} ),
Add Term( {2, 1}, {5, 1} ), Add Term( {3, 1}, {5, 1} ),
Add Term( {4, 1}, {5, 1} ), Add Term( {1, 3} ), Add Term( {1, 4} ),
Add Term( {4, 3} ), Make Strip Plot Design, Set N Whole Plots( 32 ),
Set N Subplots( 12 ), Set Sample Size( 384 ), Optimality Criterion( 2 )
);Re: Configuración de placas de 96 y 384 pocillos con réplicasAbordaría esto considerando el diseño de experimentos estadístico y la disposición física de las placas como dos pasos conectados pero separados. Una vez establecidos los factores, las interacciones y los términos cuadráticos, se pueden añadir restricciones prácticas en torno a las filas, columnas, placas y réplicas, en lugar de intentar aleatorizar completamente cada pocillo. Esto resulta especialmente útil cuando algunas variables pueden manejarse con un manipulador de líquidos, mientras que otras son más fáciles de gestionar manualmente o con pipeteo multicanal.
Para la replicación, conviene tener cuidado al colocar todas las réplicas una al lado de la otra. Si bien esto puede facilitar la configuración del experimento, también conlleva el riesgo de que un efecto local de la placa se interprete como un efecto del tratamiento. Distribuir las réplicas independientes en diferentes áreas de la placa, y preferiblemente en placas o ensayos distintos, permite detectar mejor la variación entre placas. Las réplicas técnicas pueden agruparse cuando exista una razón práctica para ello.
Para un ensayo de 384 pocillos, también crearía el mapa físico de los pocillos antes de comenzar el pipeteo. Un recurso como la plantilla para placas de 96 pocillos puede ser útil para organizar el diseño de una placa de 384 pocillos, marcando las condiciones de tratamiento, los controles, los grupos de réplicas y las posiciones de filas y columnas. Tener ese mapa visual junto a la tabla del diseño experimental facilita mucho la detección de duplicaciones accidentales o una mala colocación de los controles antes de preparar la placa.
También reservaría pocillos específicos para controles positivos, controles negativos y, posiblemente, una condición de referencia. Estos controles resultan especialmente valiosos al intentar determinar si un aparente efecto del diseño experimental es genuino o si se debe, en parte, a efectos de borde, variaciones en la dispensación, evaporación o deriva entre placas. Para el modelo, priorizaría los términos de segundo orden y las interacciones biológicamente relevantes, en lugar de añadir automáticamente términos cúbicos, ya que los términos de orden superior innecesarios pueden consumir muchos grados de libertad experimentales.
