レプリケートを使用した 96 および 384 ウェルプレートデザインのセットアップJMP 科学者の皆さん、
私はいくつかの細胞ベースのアッセイ開発プロジェクトに取り組んでおり、DOE を使用して実験で制御できるパラメーターの最適化を試みています。
適切なレベルの複製を取得し、エッジ効果を回避するために 96 ウェル プレートと 384 ウェル プレートのレイアウトを設定するのは、少々面倒です。 ロボットでプレート全体をランダム化することを含まない良い戦略はありますか? (ただし、ランダム化に適した特定の変数用のリキッド ハンドラーはあります) どのような種類の計画とどのような項 (相互作用、二次関数、三次関数など) デザインに落とし込んでいますか？ DOE カスタム設計ジェネレーターで「複製」をどのように処理しますか。 できるだけ多くのフィードバックをもらいたいと思っています。 私は DOE の力と有用性を理解しています。私は改宗者ですが、この取り組みを最終的に軌道に乗せ、それを日常のアッセイ開発や実験計画に活用するのに助けが必要です。
ありがとう！
実験計画法Re: JMP 科学者への呼びかけしたがって、これにより、さらに複雑さが追加されます。 考慮すべき実際的な解決策は、細胞濃度の異なるプレートを使用して、薬物、緩衝液、血清について同じプレート レイアウトを繰り返すことです。 次に、インキュベーション時間に対処するために、適切な時点でプレートを取り出せるように、各細胞濃度で複数のプレートを準備します。
もちろんセル濃度も。二次モデル項をサポートするには、少なくとも 3 つのレベルが必要です。
時間の扱い方が異なります。 各時点を個別に分析し、DOE 分析の外部で、応答対時間に曲線 (フィット曲線) を当てはめることもできます。 次に、曲線のパラメーター (傾き、漸近線、変曲点/EC50 など) が DOE テーブルの応答になります。 timeseries データのパラメータ化に関する投稿がまだない場合は、後で誰か (または私) にとって良いトピックになるでしょう。
これはかなり大規模な実験になる可能性がありますが、ピペッティング ロボットはそのために役立ちます。
おまけの質問です。 プロット全体とサブプロットの変更は、要因が非常に少ないため、ほとんどまたはまったく影響を及ぼさないと予想しています。 ただし、すべてと同じように、最初に確認してください。 両方のデザインを作成し、デザイン比較ツール (DOE/デザイン診断) を使用します。
Re: JMP 科学者への呼びかけ非常に役立つご意見をありがとうございます!
これを使用して、次のようなデザインを作成しました。
PlateLayout.PNG
1 つのプレート上の細胞密度を変更することは可能ですが、リキッド ハンドラーを使用して細胞をピペッティングする必要があるため、非常に面倒です。 つまり、ウェル間ではなく、プレート間の細胞密度を変えたいと考えています。 もう 1 つの要因は、インキュベーション時間の変化 (ここには示されていません) ですが、これもプレート間でのみ変化させることができ、ウェル間では変化させることができません。 私のアプローチは、インキュベーション時間と細胞密度という 2 つの「ダミー」要素を実際のものとして使用することですが、それでは正しい結果が得られません。次に、交互作用や二次項などのこれらの要素をモデルに組み込む必要もあります。 私の間違いはどこですか？ または、これにどのようにアプローチすればよいでしょうか?
そして、ボーナスの質問:
エッジ効果を避けるためにエッジウェルを除外したい場合は、プロット全体の数を 6 に、サブプロットの数を 10 に設定します。
前もって感謝します！
Re: JMP 科学者への呼びかけ96 ウェル実験を構築。
Screen Shot 2017-09-12 at 5.09.17 PM.png
この DOE 構築方法を見てください。 4 つの連続因子と、設定の変更が非常に難しいハード広告のダミー変数として使用する追加の 2 つの連続因子があります。 (全体とサブプロットを構築するためのダミー変数。) 因子 X3、X4、X5、および X6 は実験事実であり、計画には相互作用とそれぞれの二次モデル項が含まれています。 ファクターX1と
X2 は、ハードとして設定されており、変更するのが非常に難しいメインエフェクトです。
(Stat Speak からの翻訳: ランダムなプレート レイアウトをピペッティングできるロボットをお持ちの場合、DOE テーブルにもプレートの位置が含まれていれば便利です。 この例では、「サブプロット」と「全体プロット」というラベルが付けられるプレート位置を JMP に強制的に与えます。 これを機能させるために、追加する最初の 2 つの因子/変数/入力/X は単なるダミーになります。 最初のダミー X を変更しにくくし、2 番目の X を変更しにくくします。 ここから、薬物、阻害剤、緩衝剤、補因子、栄養素、炭素源、または研究に興味のあるものなど、他の変数を追加します。 次に、通常のように、相互作用や二次関数などの項をモデルに追加します。 ダミーの X を交互作用や 2 次項に含めないように十分注意してください。 必要なのはメインエフェクトだけです。
この最後のステップは、これを機能させるために重要です。スキップしないでください。 「変更が難しい要因は、変更が非常に難しい要因とは独立して変化する可能性がある」というオプションがあります。 これは必ずチェックしてください。 スクリプトを見ると、引数に「Make Strip Plot Design」があることがわかります。 このオプションをオンにすると、スクリプト内でそのビットが発生します。 (統計の話: JMP は、相互に独立した全体プロットとサブプロットのランダム化に制限を設けたストリップ プロット デザインを作成できます。) 次の部分も重要です。 全体プロットとサブプロットの数を設定し、次に実行数を設定します。 プロットの 1 つは 8、もう 1 つは 12 である必要があり、実行数は 64 です。 以前は、実験用に 8 カラムだけを予約し、最後の 3 つをコントロールと標準曲線に使用していました。 この場合、全体プロットとサブプロットは両方とも 8 で、実行数は 64 です。 設計テーブルを作成したら、その設計をロボットに渡してピペッティングするのはそれほど難しくありません。)
Screen Shot 2017-09-12 at 5.14.56 PM.png
生成されたデザインでは、JMP は 96 ウェルのそれぞれの位置として使用できる 2 つの列に 8 つの全体プロットと 12 のサブプロットを提供します。 以下の図では、X3、X4、X5、および X6 にはランダム化に関する制限がなく、変数ごとに異なるパターンが明らかであり、4 つのグリッドで表されています。
実験が完了したら、モデルに 2 つのダミー変数を含めないように注意することが重要です。 デフォルトでは、これらはモデル スクリプト内に含まれます。
デザインスクリプト
DOE(
Custom Design,
{Add Response( Maximize, "Y", ., ., . ),
Add Factor( Continuous, -1, 1, "whole plot dummy", 1 ),
Add Factor( Continuous, -1, 1, "sub plot dummy", 2 ),
Add Factor( Continuous, -1, 1, "X3", 0 ),
Add Factor( Continuous, -1, 1, "X4", 0 ),
Add Factor( Continuous, -1, 1, "X5", 0 ),
Add Factor( Continuous, -1, 1, "X6", 0 ), Set Random Seed( 42 ),
Number of Starts( 10 ), Add Term( {1, 0} ), Add Term( {1, 1} ),
Add Term( {2, 1} ), Add Term( {3, 1} ), Add Term( {4, 1} ), Add Term( {5, 1} ),
Add Term( {6, 1} ), Add Term( {3, 1}, {4, 1} ), Add Term( {3, 1}, {5, 1} ),
Add Term( {3, 1}, {6, 1} ), Add Term( {4, 1}, {5, 1} ),
Add Term( {4, 1}, {6, 1} ), Add Term( {5, 1}, {6, 1} ), Add Term( {3, 2} ),
Add Term( {4, 2} ), Add Term( {5, 2} ), Add Term( {6, 2} ),
Make Strip Plot Design, Set N Whole Plots( 8 ), Set N Subplots( 12 ),
Set Sample Size( 96 ), Optimality Criterion( 2 ), Make Design}
);
Re: JMP 科学者への呼びかけここでの抵抗の一部は、私たちが使用する言語にあるかもしれません。 おそらくそうあるべきだった言語。 科学者は、プレートとウェル、ピペッティングと希釈、インキュベーション時間、濃度などについて話します。 一方、統計学者は（カスタム設計の場合は JMP ユーザー インターフェイスを介して間接的に、ここでは返信を通じて直接）因子の種類、因子レベルの変更が簡単、難しい、または非常に難しい、プロット全体とサブプロット、ブロックについて話します。 、 等々。
全部わかりましたか？ おそらくそうではありません。 それは普通のことです。
したがって、ディスカッションに参加している他の人たちに自分たちのことを説明するために時間を割く必要があります。 トピックや問題が高度であればあるほど、問題と解決策を完全に伝えるためにはより多くの説明が必要になります。
Re: JMP 科学者への呼びかけこの設計の問題は、ランダム化に制限を設けた洗練された実験は重要であるため、この議論は同様の状況にある多くのユーザーに役立つ可能性があります。 これは、JMP コミュニティのこのディスカッション エリアが私たち全員にとって望ましいものであることを示す素晴らしい例です。 一週間何も活動がなかったので当惑しています。 前回の返信で残りの質問がすべて解決されたからではないかと思います。
議論が再び盛り上がることを願っています。 より多くの回答を得られることを期待するいくつかのポイントを以下に示します。
- あなたがアッセイを開発する場合、このケースはあなたのケースとどのように似ていますか? どう違うのですか？
- ラン (ウェル) のランダム化に関しても同様の制限がありますか? もっと？ 少ない？ ただ違うだけ？
- ランダム化の制限は、デザインの実行がどれほど実用的であるかに明らかに影響を与えます。 制限が分析にどのような影響を与えるかは同様に明らかですか? 分析で制限が無視された場合、回帰モデルの解釈はどうなるでしょうか?
- 制限のある実験を設計、実行、または分析する際に有益だと思われる実践方法は何ですか?
(同じユーザーによって別の関連ディスカッションが開始されていることに注意してください。 この行動喚起をクロスポストするつもりです。最良の議論が勝ちますように!)
Re: JMP 科学者への呼びかけこの問題についてはおそらく厳しい意見があると思われるため、私はこの質問に潜んでいました。 96 ウェル実験をセットアップする 1 つの方法は次のとおりです。
このデザインは、私が便利だと思うことをいくつか実現しています。
実験には連続的な要因があります。
1. 研究に興味がある薬物、阻害剤
2. 刺激する、その物は薬が抑制するはずの反応を刺激する
3. 血清レベル、細胞の増殖は良好ですが、反応のバックグラウンドが増加します
そしていくつかのカテゴリ要因:
1. メディアタイプ
2. 細胞株、プレートごとに異なる細胞株
プレートのセットアップを合理的にするために、ランダム化にいくつかの制限を設けたいと思います。 時間がたくさんあれば、プレート全体を完全にランダム化するようにピペッティング ロボットをプログラムすることもできますが、ランダム化を制限するだけであれば、列全体と行全体の濃度を同じに保つことができ、プレーティングがはるかに簡単になります。
まず第一に、この範囲については、基本的に 384 ウェル、プレートあたり 96、プレート 4 枚 (細胞株ごとに 1 つ) を扱う必要があります。私が扱っている因子については、2 次を簡単に確認できます。連続項の交互作用と二次効果。 プレートをセットアップすると、12 列 32 行になります (4 つのプレートにそれぞれ 8 行)。
DOE ダイアログで、行と列のランダム化を制限します。 これは、一部の要素を変更するのが「困難」にし、一部の要素を「非常に困難」にすることを意味し、これが分割ストリップ プロット実験になります。 プロット全体は難しい要因に対応し、サブプロットは変更が非常に難しい要因に対応します。 したがって、12 のサブプロットと 32 (8x4) の全体プロットがある場合、変更が難しいもの (この場合は薬物と血清) は列の下で一定となり、各行はプレート全体で同じになります。 これについてもう少し説明しましょう。 各カラムの濃度は異なりますが、濃度はカラム全体で同じです。 (独自のプレートをマルチチャンネルでピペッティングする場合に非常に便利です。)
最後に考慮すべきことは、プレート/細胞株です。 本当に必要なのは 3 方向分割プロットなので、細胞株/プレートは「変更が非常に難しい」ことになりますが、それはオプションではありません。各プレートの列に異なるサブプロット パターンがあればより良いかもしれません。しかし、これはかなり良いです。 (現実的には、8 つの全体プロットと 12 のサブプロットを作成し、4 つの細胞株のそれぞれに同じプレート レイアウトを使用するだけでおそらく十分であり、さらにプレート レイアウトでエラーが発生する可能性が減ります。)
DOE(
Custom Design,
{Add Response( Maximize, "Y", ., ., . ),
Add Factor( Continuous, 2, 25, "Drug", 1 ),
Add Factor( Continuous, 0.02, 0.1, "Serum", 1 ),
Add Factor( Categorical, {"IMDM", "RPMI", "DMEM"}, "Media", 2 ),
Add Factor( Continuous, 5, 50, "Stim", 2 ),
Add Factor( Categorical, {"L1", "L2", "L3", "L4"}, "Plate Number", 2 ),
Set Random Seed( 550796982 ), Number of Starts( 1 ), Add Term( {1, 0} ),
Add Term( {1, 1} ), Add Term( {2, 1} ), Add Term( {3, 1} ), Add Term( {4, 1} ),
Add Term( {5, 1} ), Add Term( {1, 2} ), Add Term( {1, 1}, {2, 1} ),
Add Term( {2, 2} ), Add Term( {1, 1}, {3, 1} ), Add Term( {2, 1}, {3, 1} ),
Add Term( {1, 1}, {4, 1} ), Add Term( {2, 1}, {4, 1} ),
Add Term( {3, 1}, {4, 1} ), Add Term( {4, 2} ), Add Term( {1, 1}, {5, 1} ),
Add Term( {2, 1}, {5, 1} ), Add Term( {3, 1}, {5, 1} ),
Add Term( {4, 1}, {5, 1} ), Add Term( {1, 3} ), Add Term( {1, 4} ),
Add Term( {4, 3} ), Make Strip Plot Design, Set N Whole Plots( 32 ),
Set N Subplots( 12 ), Set Sample Size( 384 ), Optimality Criterion( 2 )
);Re: 96ウェルおよび384ウェルプレート設計のセットアップと複製について統計的実験計画法（DOE）と物理的なプレートレイアウトを、関連性はあるものの独立した2つのステップとして扱うことで、この問題に対処します。因子、相互作用、および二次項が確立されたら、すべてのウェルを完全にランダム化しようとするのではなく、行、列、プレート、および反復実験に関する実用的な制約を追加できます。これは、一部の変数を液体ハンドラーで処理できる一方で、他の変数は手動またはマルチチャンネルピペッティングで管理しやすい場合に特に有効です。
再現実験を行う際は、すべての複製サンプルを隣り合わせに配置するのは避けた方が良いでしょう。実験のセットアップは容易になりますが、プレート固有の効果が処理効果として誤って解釈されるリスクが生じます。独立した複製サンプルをプレートの異なる領域、できれば別々のプレートまたは実験に分散させることで、プレート間のばらつきをより正確に検出できます。ただし、実務上の理由がある場合は、技術的複製サンプルをグループ化することも可能です。
384ウェルアッセイの場合、ピペット操作を開始する前に、ウェル配置図を作成することをお勧めします。96 ウェルプレートテンプレートなどのリソースは、384ウェルプレートのレイアウトを整理し、処理条件、コントロール、反復グループ、行/列の位置をマークするのに役立ちます。この視覚的なマップを実験計画法（DOE）表の横に置いておくことで、プレートを実際に準備する前に、意図しない重複やコントロールの不適切な配置を容易に発見できます。
また、陽性対照、陰性対照、そして場合によっては参照条件用の専用ウェルも用意しておきたいと思います。これらの対照は、見かけ上の実験計画法（DOE）効果が本当に存在するのか、それとも端部効果、分注のばらつき、蒸発、あるいはプレート間のドリフトなどが原因であるのかを判断する際に特に役立ちます。モデルについては、不要な高次項は実験の自由度を大量に消費してしまうため、自動的に3次項を追加するよりも、2次項と生物学的に意味のある相互作用を優先的に考慮することをお勧めします。
