Impostazione di progetti di piastre da 96 e 384 pozzetti con replicatiSalve scienziati JMP,
Sto lavorando ad alcuni progetti di sviluppo di test basati su cellule in cui utilizzo DOE per cercare di ottimizzare i parametri che posso controllare negli esperimenti.
Impostare i layout per piastre da 96 e 384 pozzetti per ottenere un livello ragionevole di replica ed evitare effetti bordo è una specie di seccatura. Esistono delle buone strategie che non implicano la randomizzazione dell'intero piatto con un robot? (anche se ho un gestore liquido per alcune variabili che sono più suscettibili alla randomizzazione) Che tipi di progetti e quali termini (ad esempio interazioni, quadratico, cubico..) ti stai impegnando nei disegni? Come gestisci le "repliche" nel generatore di progetti personalizzati DOE. Sono curioso di ricevere quanti più feedback possibili. Comprendo la potenza e l'utilità del DOE, sono un convertito, ma ho solo bisogno di aiuto per far finalmente decollare questo sforzo e utilizzarlo nello sviluppo quotidiano dei test e nella progettazione sperimentale.
Grazie!
Progettazione di esperimentiRi: Un appello agli scienziati JMPQuindi, questo aggiunge un po’ più di complessità. Una soluzione pratica da considerare è ripetere la stessa disposizione delle piastre per farmaco, tampone e siero, con piastre di concentrazione cellulare diverse. Quindi, per affrontare i tempi di incubazione, potrei preparare più piastre a ciascuna concentrazione cellulare in modo da poter estrarre le piastre nei punti temporali appropriati.
Naturalmente la cella conc. dovranno essere almeno tre livelli per supportare un termine del modello quadratico.
Il tempo viene gestito diversamente. Potrei analizzare ogni punto temporale separatamente E adatterei una curva (Curva di adattamento) alla risposta rispetto al tempo, al di fuori dell'analisi DOE. Quindi i parametri della curva (come pendenza, asintoto, punto di flesso/EC50) diventerebbero risposte nella tabella DOE. Se non esiste già un post sulla parametrizzazione dei dati delle serie temporali, sarebbe un buon argomento per qualcuno (o me) in seguito.
Questo può diventare un esperimento abbastanza grande, ma è a questo che servono i robot di pipettaggio.
Per la domanda bonus. Mi aspetto che il cambiamento in intere trame e sottotrame avrà poco o nessun effetto con così pochi fattori. Ma come ogni cosa, verifica prima. Realizza entrambi i progetti e quindi utilizza lo strumento Confronto progetti (DOE/Design Diagnostics).
Ri: Un appello agli scienziati JMPGrazie per il contributo molto utile!
Usando questo, ho creato un disegno che sarebbe simile a questo:
PlateLayout.PNG
Ora, variare la densità cellulare su una piastra è possibile ma piuttosto noioso perché il pipettaggio delle cellule con un gestore di liquidi deve essere eseguito con attenzione. In breve: vorrei variare la densità cellulare tra le piastre ma non nei pozzetti. Un altro fattore potrebbe essere la variazione del tempo di incubazione (non mostrato qui), che può essere variato solo tra piastre e non tra pozzetti. Il mio approccio sarebbe quello di utilizzare i due fattori "fittizi" come il vero affare, vale a dire il tempo di incubazione e la densità cellulare, ma ciò non fornisce il risultato corretto.Quindi, dovrei anche includere questi fattori nel mio modello, inclusi l'interazione e i termini quadratici. Dov'è il mio errore? Oppure come dovrei affrontare la cosa?
E domanda bonus:
Se voglio tralasciare i pozzetti dei bordi per evitare l'effetto bordo, imposterei il numero di intere trame su 6 e le sottotrame su 10?
Grazie in anticipo!
Ri: Un appello agli scienziati JMPRealizzazione di 96 esperimenti con pozzi.
Screen Shot 2017-09-12 at 5.09.17 PM.png
Dai un'occhiata a questo metodo di costruzione DOE. Sono presenti 4 fattori continui e 2 fattori continui aggiuntivi da utilizzare come variabili fittizie per le impostazioni difficili e molto difficili da modificare. (variabili fittizie per costruire l'intero e le sottotrame.) I fattori X3, X4, X5 e X6 sono i fatti sperimentali, il progetto include termini di interazione e modello quadratico per ciascuno di essi. Fattori X1 e
X2 sono gli effetti principali impostati come difficili e molto difficili da modificare.
(Tradotto da Stat Speak: se disponi di un robot in grado di pipettare un layout di piastre casuale, sarebbe conveniente se anche la tua tabella DOE contenesse le posizioni delle piastre. In questo esempio, forzerò JMP a fornirmi le posizioni delle piastre che verranno etichettate "Sottotrama" e "Trama intera". Affinché funzioni, i primi due fattori/variabili/input/X che aggiungo saranno semplicemente fittizi. Rendi la prima X fittizia difficile da cambiare e rendi la seconda X molto difficile da cambiare. Da qui aggiungi le altre variabili come farmaco, inibitore, tampone, cofattore, nutriente, fonte di carbonio o qualunque cosa ti interessi studiare. Quindi, come al solito, aggiungi i termini, come interazioni e quadratiche, al modello. Fai molta attenzione a non includere le X fittizie nelle interazioni e nei termini quadratici. Tutto ciò di cui abbiamo bisogno sono gli effetti principali.
Quest'ultimo passaggio è fondamentale per far funzionare il tutto, non saltarlo. Esiste un'opzione: "I fattori difficili da modificare possono variare indipendentemente dai fattori molto difficili da modificare". Questo DEVE essere controllato. Dai un'occhiata allo script e noterai questo: "Make Strip Plot Design", nell'argomento. L'attivazione di questa opzione fa sì che quel bit si verifichi nello script. (Le statistiche parlano: JMP può realizzare progetti di strip plot con restrizioni sulla randomizzazione per intere e sottotrame indipendenti l'una dall'altra.) Anche la parte successiva è importante. Impostare il numero di intere trame e sottotrame, quindi il numero di esecuzioni. Uno dei grafici dovrebbe essere 8 e l'altro dovrebbe essere 12, e il numero di esecuzioni è 64. In passato avrei riservato solo 8 colonne per l'esperimento, quindi avrei utilizzato le ultime tre per i controlli e le curve standard. In questo caso, le trame intere e le sottotrame sono entrambe 8 e le sequenze = 64. Dopo aver creato la tabella di progettazione, non dovrebbe essere troppo difficile passare il progetto al robot per il pipettaggio.)
Screen Shot 2017-09-12 at 5.14.56 PM.png
Nel disegno generato, JMP fornisce le 8 trame intere e le 12 sottotrame in due colonne che possono essere utilizzate come posizione di ciascuno dei 96 pozzi. Nella figura seguente, X3, X4, X5 e X6 non hanno restrizioni sulla randomizzazione ed è evidente uno schema diverso per ciascuna variabile, rappresentata come quattro griglie.
Una volta completato l'esperimento, sarà importante ricordarsi di non includere le due variabili dummy nel modello. Per impostazione predefinita questi saranno nello script del modello.
Scrittura di progettazione
DOE(
Custom Design,
{Add Response( Maximize, "Y", ., ., . ),
Add Factor( Continuous, -1, 1, "whole plot dummy", 1 ),
Add Factor( Continuous, -1, 1, "sub plot dummy", 2 ),
Add Factor( Continuous, -1, 1, "X3", 0 ),
Add Factor( Continuous, -1, 1, "X4", 0 ),
Add Factor( Continuous, -1, 1, "X5", 0 ),
Add Factor( Continuous, -1, 1, "X6", 0 ), Set Random Seed( 42 ),
Number of Starts( 10 ), Add Term( {1, 0} ), Add Term( {1, 1} ),
Add Term( {2, 1} ), Add Term( {3, 1} ), Add Term( {4, 1} ), Add Term( {5, 1} ),
Add Term( {6, 1} ), Add Term( {3, 1}, {4, 1} ), Add Term( {3, 1}, {5, 1} ),
Add Term( {3, 1}, {6, 1} ), Add Term( {4, 1}, {5, 1} ),
Add Term( {4, 1}, {6, 1} ), Add Term( {5, 1}, {6, 1} ), Add Term( {3, 2} ),
Add Term( {4, 2} ), Add Term( {5, 2} ), Add Term( {6, 2} ),
Make Strip Plot Design, Set N Whole Plots( 8 ), Set N Subplots( 12 ),
Set Sample Size( 96 ), Optimality Criterion( 2 ), Make Design}
);
Ri: Un appello agli scienziati JMPParte della riluttanza qui potrebbe essere il linguaggio che usiamo. Forse avrebbe dovuto essere così le lingue . Lo scienziato parla di piastre e pozzetti, pipettaggio e diluizione, tempo di incubazione, concentrazione e così via. Lo statistico, d'altro canto, (indirettamente attraverso l'interfaccia utente di JMP per la progettazione personalizzata e direttamente attraverso le risposte qui) parla di tipi di fattori, livelli di fattore facili, difficili o molto difficili da modificare, interi grafici e sotto-grafici, blocchi , e così via.
Hai capito tutto? Probabilmente no. È normale.
Quindi dobbiamo prenderci il tempo per spiegarci alle altre persone coinvolte nella discussione. Più l’argomento e i problemi sono avanzati, maggiori saranno le spiegazioni necessarie per comunicare pienamente il problema e la soluzione.
Ri: Un appello agli scienziati JMPPenso che questa questione di progettare a esperimento sofisticato con restrizioni sulla randomizzazione è importante e, pertanto, questa discussione potrebbe aiutare molti utenti in una situazione simile. È un ottimo esempio di ciò che speravamo potesse essere per tutti noi quest'area di discussione nella comunità JMP. Sono sconcertato dal fatto che non ci sia stata alcuna attività per una settimana. Dubito che ciò sia dovuto al fatto che l'ultima risposta ha risposto a tutte le rimanenti domande.
Spero che la discussione riprenda. Ecco alcuni punti che spero suscitino più risposte:
- In che modo questo caso è simile al tuo se sviluppi test? In cosa è diverso?
- Hai le stesse restrizioni sulla randomizzazione delle esecuzioni (pozzi)? Di più? Meno? Solo diverso?
- Le restrizioni sulla randomizzazione influiscono chiaramente sulla praticità di esecuzione del progetto. È altrettanto chiaro l’impatto della restrizione sull’analisi? Cosa potrebbe accadere alla mia interpretazione del modello di regressione se la restrizione venisse ignorata nell'analisi?
- Quali sono alcune pratiche che ritieni utili durante la progettazione, l'esecuzione o l'analisi di un esperimento con restrizioni?
(Nota che esiste un'altra discussione correlata avviata dallo stesso utente. Invierò questo invito all'azione e che vinca la discussione migliore!)
Ri: Un appello agli scienziati JMPSono stato in agguato su questa domanda perché sono sicuro che probabilmente ci sono alcune opinioni forti su questo argomento. Ecco un modo per impostare un esperimento da 96 pozzetti.
Questo design fa alcune cose che penso siano utili.
Nell'esperimento ci sono fattori continui:
1. Farmaco, un inibitore che mi interessa studiare
2. Stim, la cosa stimola una risposta che il farmaco dovrebbe inibire
3. A livello del siero, fa crescere meglio le cellule ma aumenta il fondo della risposta
e alcuni fattori categorici:
1. Tipo di supporto
2. Linea cellulare, linea cellulare diversa per ciascuna piastra
Per rendere ragionevole la configurazione delle piastre, voglio porre alcune restrizioni alla randomizzazione. Se avessi molto tempo, potrei programmare il robot di pipettaggio per randomizzare completamente l'intera piastra, ma se limiti solo la randomizzazione posso mantenere le concentrazioni lungo le colonne e tra le righe allo stesso modo, e la placcatura diventa molto più semplice.
Prima di tutto, per lo scopo di questo, ho essenzialmente 384 pozzetti con cui lavorare, 96 per piastra e 4 piastre (una per ogni linea cellulare). Per i fattori con cui sto lavorando, posso facilmente guardare il 2° ordine Interazioni ed effetti quadratici per i termini continui. Quando installo le piastre ho 12 colonne e 32 righe (8 righe per ciascuna delle 4 piastre).
Nella finestra di dialogo DOE, limiterò la randomizzazione per righe e colonne. Ciò significa rendere alcuni fattori "difficili" da modificare e altri "molto difficili", il che rende questo esperimento con trama a strisce divise. Intere trame corrispondono a fattori difficili e le sottotrame corrispondono a fattori molto difficili da modificare. Quindi, se ho 12 sottotrame e 32 (8x4) intere trame, allora le cose difficili da cambiare (in questo caso Farmaco e Siero) saranno costanti lungo le colonne e ogni singola riga sarà la stessa su tutta la piastra. Lasciatemi spiegare questo un po' di più. Ogni colonna ha una concentrazione diversa, la concentrazione è la stessa lungo tutta la colonna. (Molto utile se stai pipettando multicanale le tue piastre.)
L'ultima cosa da considerare è la linea di piastre/cellule. Ciò di cui ho veramente bisogno è una trama divisa in tre parti, quindi la linea cellulare/piastra sarebbe "super difficile da cambiare", ma questa non è un'opzione, e potrebbe essere meglio se ci fosse un modello di sottotrama diverso per le colonne di ciascuna piastra, ma questo è abbastanza buono (realisticamente, creare semplicemente 8 intere trame e 12 sottotrame e utilizzare lo stesso layout delle piastre per ciascuna delle quattro linee cellulari è probabilmente sufficiente, inoltre riduce le possibilità di errore nel layout delle piastre.)
DOE(
Custom Design,
{Add Response( Maximize, "Y", ., ., . ),
Add Factor( Continuous, 2, 25, "Drug", 1 ),
Add Factor( Continuous, 0.02, 0.1, "Serum", 1 ),
Add Factor( Categorical, {"IMDM", "RPMI", "DMEM"}, "Media", 2 ),
Add Factor( Continuous, 5, 50, "Stim", 2 ),
Add Factor( Categorical, {"L1", "L2", "L3", "L4"}, "Plate Number", 2 ),
Set Random Seed( 550796982 ), Number of Starts( 1 ), Add Term( {1, 0} ),
Add Term( {1, 1} ), Add Term( {2, 1} ), Add Term( {3, 1} ), Add Term( {4, 1} ),
Add Term( {5, 1} ), Add Term( {1, 2} ), Add Term( {1, 1}, {2, 1} ),
Add Term( {2, 2} ), Add Term( {1, 1}, {3, 1} ), Add Term( {2, 1}, {3, 1} ),
Add Term( {1, 1}, {4, 1} ), Add Term( {2, 1}, {4, 1} ),
Add Term( {3, 1}, {4, 1} ), Add Term( {4, 2} ), Add Term( {1, 1}, {5, 1} ),
Add Term( {2, 1}, {5, 1} ), Add Term( {3, 1}, {5, 1} ),
Add Term( {4, 1}, {5, 1} ), Add Term( {1, 3} ), Add Term( {1, 4} ),
Add Term( {4, 3} ), Make Strip Plot Design, Set N Whole Plots( 32 ),
Set N Subplots( 12 ), Set Sample Size( 384 ), Optimality Criterion( 2 )
);Oggetto: Impostazione di piastre a 96 e 384 pozzetti con replicheAffronterei la questione trattando la progettazione sperimentale statistica e la disposizione fisica delle piastre come due fasi distinte ma connesse. Una volta definiti i fattori, le interazioni e i termini quadratici, è possibile aggiungere vincoli pratici relativi a righe, colonne, piastre e repliche, anziché tentare di randomizzare completamente ogni pozzetto. Questo approccio risulta particolarmente utile quando alcune variabili possono essere gestite da un sistema di manipolazione dei liquidi, mentre altre sono più facili da gestire manualmente o con la pipettatura multicanale.
Per quanto riguarda la replicazione, farei attenzione a posizionare tutte le repliche una accanto all'altra. Questo può semplificare l'allestimento dell'esperimento, ma crea anche il rischio che un effetto locale della piastra venga interpretato come un effetto del trattamento. Distribuire le repliche indipendenti in diverse aree della piastra, e preferibilmente su piastre o cicli separati, offre un metodo migliore per rilevare la variabilità tra le piastre. Le repliche tecniche possono comunque essere raggruppate quando vi è una ragione pratica per farlo.
Per un test a 384 pozzetti, consiglierei di creare anche la mappa fisica dei pozzetti prima di iniziare il pipettaggio. Una risorsa come il modello per piastre a 96 pozzetti può essere utile in questo caso per organizzare il layout di una piastra a 384 pozzetti, contrassegnando le condizioni di trattamento, i controlli, i gruppi di replica e le posizioni di righe e colonne. Avere questa mappa visiva accanto alla tabella DOE rende molto più facile individuare duplicazioni accidentali o un posizionamento errato dei controlli prima che la piastra venga effettivamente preparata.
Lascerei inoltre dei pozzetti dedicati per i controlli positivi, i controlli negativi e, possibilmente, una condizione di riferimento. Questi controlli diventano particolarmente utili quando si cerca di determinare se un apparente effetto DOE sia genuino o parzialmente causato da effetti di bordo, variazioni di dispensazione, evaporazione o deriva tra le piastre. Per il modello, darei la precedenza ai termini di secondo ordine e alle interazioni biologicamente significative piuttosto che aggiungere automaticamente termini cubici, poiché termini di ordine superiore non necessari possono consumare molti gradi di libertà sperimentali.
