Einrichten von 96- und 384-Well-Plattendesigns mit ReplikatenHallo JMP-Wissenschaftler,
Ich arbeite an einigen zellbasierten Assay-Entwicklungsprojekten, bei denen ich DOEs verwende, um zu versuchen, die Parameter zu optimieren, die ich in den Experimenten steuern kann.
Das Einrichten der Layouts für 96- und 384-Well-Platten, um ein angemessenes Replikationsniveau zu erreichen und Kanteneffekte zu vermeiden, ist ziemlich mühsam. Gibt es einige gute Strategien, bei denen nicht der gesamte Teller mit einem Roboter randomisiert werden muss? (obwohl ich einen Liquid-Handler für bestimmte Variablen habe, die sich besser für die Randomisierung eignen) Welche Arten von Designs und welche Begriffe (z. B. Interaktionen, quadratisch, kubisch ...) Nimmst du an den Entwürfen teil? Wie gehen Sie mit „Replikaten“ im DOE-Generator für benutzerdefinierte Designs um? Ich bin gespannt darauf, so viel Feedback wie möglich zu bekommen. Ich verstehe die Leistungsfähigkeit und den Nutzen von DOE, ich bin ein Konvertit, aber ich brauche einfach Hilfe, diese Bemühungen endlich auf den Weg zu bringen und sie in unserer täglichen Assay-Entwicklung und unserem experimentellen Design zu nutzen.
Danke schön!
VersuchsplanungBetreff: Ein Anruf an JMP-WissenschaftlerDas führt also zu etwas mehr Komplexität. Eine praktische Lösung besteht darin, das gleiche Plattenlayout für Arzneimittel, Puffer und Serum mit unterschiedlichen Zellkonzentrationsplatten zu wiederholen. Um dann die Inkubationszeiten zu berücksichtigen, bereite ich möglicherweise mehrere Platten mit jeder Zellkonzentration vor, damit ich die Platten zu geeigneten Zeitpunkten entnehmen kann.
Natürlich ist die Zellkonzentration. muss mindestens drei Ebenen haben, um einen quadratischen Modellterm zu unterstützen.
Mit der Zeit wird anders umgegangen. Ich könnte jeden Zeitpunkt separat analysieren UND außerhalb der DOE-Analyse eine Kurve (Fit Curve) an die Reaktion im Vergleich zur Zeit anpassen. Dann würden die Parameter der Kurve (wie Steigung, Asymptote, Wendepunkt/EC50) zu Antworten in der DOE-Tabelle. Wenn es noch keinen Beitrag zur Parametrisierung von Zeitreihendaten gibt, dann wäre das später ein gutes Thema für jemanden (oder mich).
Das kann ein ziemlich großes Experiment werden, aber genau dafür sind Pipettierroboter da.
Zur Bonusfrage. Ich gehe davon aus, dass die Änderung ganzer Handlungsstränge und Nebenhandlungen bei so wenigen Faktoren kaum oder gar keine Auswirkungen haben wird. Aber wie bei allem: Überprüfen Sie es zuerst. Erstellen Sie beide Designs und verwenden Sie dann das Design-Vergleichstool (DOE/Design Diagnostics).
Betreff: Ein Anruf an JMP-WissenschaftlerVielen Dank für den sehr hilfreichen Beitrag!
Damit habe ich ein Design erstellt, das so aussehen würde:
PlateLayout.PNG
Nun ist es möglich, die Zelldichte auf einer Platte zu variieren, aber recht mühsam, da das Pipettieren der Zellen mit einem Liquid Handler sorgfältig erfolgen muss. Kurz gesagt: Ich möchte die Zelldichte zwischen den Platten variieren, aber nicht in den Vertiefungen. Ein weiterer Faktor wäre eine unterschiedliche Inkubationszeit (hier nicht dargestellt), die auch nur zwischen den Platten und nicht zwischen den Vertiefungen variiert werden kann. Mein Ansatz wäre, die beiden „Dummy“-Faktoren als echte Faktoren zu verwenden, nämlich Inkubationszeit und Zelldichte, aber das führt nicht zum richtigen Ergebnis.Dann müsste ich diese Faktoren auch in mein Modell einbeziehen, einschließlich Interaktion und quadratischer Terme. Wo ist mein Fehler? Oder wie soll ich das angehen?
Und Bonusfrage:
Wenn ich die Randbrunnen weglassen möchte, um den Randeffekt zu vermeiden, würde ich die Anzahl der gesamten Parzellen auf 6 und der Unterplots auf 10 setzen?
Dank im Voraus!
Betreff: Ein Anruf an JMP-WissenschaftlerBau von 96-Brunnen-Experimenten.
Screen Shot 2017-09-12 at 5.09.17 PM.png
Schauen Sie sich diese DOE-Konstruktionsmethode an. Es gibt 4 kontinuierliche Faktoren und 2 zusätzliche kontinuierliche Faktoren, die als Dummy-Variablen für die harten und sehr schwer zu ändernden Einstellungen verwendet werden können. (Dummy-Variablen zur Konstruktion des Ganzen und der Unterdiagramme.) Die Faktoren X3, X4, X5 und X6 sind die experimentellen Fakten, der Entwurf umfasst Interaktion und quadratische Modellterme für jeden von ihnen. Faktoren X1 und
X2 sind Haupteffekte, die als „hart“ und „sehr schwer zu ändern“ eingestellt sind.
(Übersetzt aus Stat Speak: Wenn Sie einen Roboter haben, der eine zufällige Plattenanordnung pipettieren kann, wäre es praktisch, wenn Ihre DOE-Tabelle auch Plattenpositionen enthalten würde. In diesem Beispiel werde ich JMP dazu zwingen, mir Plattenpositionen zuzuweisen, die mit „Subplot“ und „Whole Plot“ gekennzeichnet werden. Damit dies funktioniert, werden die ersten beiden Faktoren/Variablen/Eingaben/X, die ich hinzufüge, nur Dummys sein. Machen Sie das erste Dummy-X schwer änderbar und machen Sie das zweite Dummy-X sehr schwer änderbar. Fügen Sie von hier aus Ihre anderen Variablen wie Medikament, Inhibitor, Puffer, Co-Faktor, Nährstoff, Kohlenstoffquelle oder was auch immer Sie untersuchen möchten, hinzu. Fügen Sie dann wie gewohnt die Terme wie Interaktionen und Quadrate zum Modell hinzu. Achten Sie sehr darauf, die Dummy-Xs nicht in die Interaktionen und quadratischen Terme einzubeziehen. Alles, was wir brauchen, sind die Haupteffekte.
Dieser letzte Schritt ist entscheidend, damit dies funktioniert. Überspringen Sie ihn nicht. Es gibt die Option „Schwer zu ändernde Faktoren können unabhängig von sehr schwer zu ändernden Faktoren variieren.“ Dies MUSS überprüft werden. Schauen Sie sich das Skript an und Sie werden Folgendes bemerken: „Make Strip Plot Design“ im Argument. Wenn Sie diese Option aktivieren, wird dieses Bit im Skript angezeigt. (Statistik spricht für sich: JMP kann Streifenplot-Designs mit Einschränkungen bei der Randomisierung für ganze und voneinander unabhängige Teilplots erstellen.) Der nächste Teil ist ebenfalls wichtig. Legen Sie die Anzahl der Gesamtplots und Unterplots und dann die Anzahl der Durchläufe fest. Einer der Plots sollte 8 und der andere 12 betragen, und die Anzahl der Durchläufe beträgt 64. Früher hatte ich nur 8 Spalten für das Experiment reserviert und die letzten drei dann für Kontrollen und Standardkurven verwendet. In diesem Fall betragen sowohl die gesamten Plots als auch die Unterplots 8 und die Anzahl der Durchläufe = 64. Nachdem Sie die Designtabelle erstellt haben, sollte es nicht allzu schwierig sein, das Design zum Pipettieren an Ihren Roboter weiterzugeben.)
Screen Shot 2017-09-12 at 5.14.56 PM.png
Im generierten Entwurf stellt JMP die 8 Gesamt- und 12 Unterplots in zwei Spalten bereit, die als Standort für jedes der 96 Bohrlöcher verwendet werden können. In der folgenden Abbildung unterliegen X3, X4, X5 und
Nach Abschluss des Experiments ist es wichtig, daran zu denken, die beiden Dummy-Variablen nicht in das Modell einzubeziehen. Standardmäßig befinden sich diese im Modellskript.
Design-Skript
DOE(
Custom Design,
{Add Response( Maximize, "Y", ., ., . ),
Add Factor( Continuous, -1, 1, "whole plot dummy", 1 ),
Add Factor( Continuous, -1, 1, "sub plot dummy", 2 ),
Add Factor( Continuous, -1, 1, "X3", 0 ),
Add Factor( Continuous, -1, 1, "X4", 0 ),
Add Factor( Continuous, -1, 1, "X5", 0 ),
Add Factor( Continuous, -1, 1, "X6", 0 ), Set Random Seed( 42 ),
Number of Starts( 10 ), Add Term( {1, 0} ), Add Term( {1, 1} ),
Add Term( {2, 1} ), Add Term( {3, 1} ), Add Term( {4, 1} ), Add Term( {5, 1} ),
Add Term( {6, 1} ), Add Term( {3, 1}, {4, 1} ), Add Term( {3, 1}, {5, 1} ),
Add Term( {3, 1}, {6, 1} ), Add Term( {4, 1}, {5, 1} ),
Add Term( {4, 1}, {6, 1} ), Add Term( {5, 1}, {6, 1} ), Add Term( {3, 2} ),
Add Term( {4, 2} ), Add Term( {5, 2} ), Add Term( {6, 2} ),
Make Strip Plot Design, Set N Whole Plots( 8 ), Set N Subplots( 12 ),
Set Sample Size( 96 ), Optimality Criterion( 2 ), Make Design}
);
Betreff: Ein Anruf an JMP-WissenschaftlerEin Teil der Zurückhaltung hier könnte an der Sprache liegen, die wir verwenden. Vielleicht hätte das so sein sollen Sprachen . Der Wissenschaftler spricht über Platten und Vertiefungen, Pipettieren und Verdünnen, Inkubationszeit, Konzentration und so weiter. Der Statistiker hingegen (indirekt über die JMP-Benutzeroberfläche für benutzerdefiniertes Design und direkt über Antworten hier) spricht über Arten von Faktoren, einfach, schwer oder sehr schwer zu ändernde Faktorstufen, ganze Diagramme und Unterdiagramme, Blockierung , und so weiter.
Hast du das alles verstanden? Wahrscheinlich nicht. Das ist normal.
Deshalb müssen wir uns die Zeit nehmen, uns den anderen Diskussionsteilnehmern zu erklären. Je fortgeschrittener das Thema und die Probleme sind, desto mehr Erläuterungen sind erforderlich, um das Problem und die Lösung vollständig zu kommunizieren.
Betreff: Ein Anruf an JMP-WissenschaftlerIch denke, dass diese Frage der Gestaltung eines anspruchsvolles Experiment mit Einschränkungen bei der Randomisierung ist wichtig und daher könnte diese Diskussion vielen Benutzern in einer ähnlichen Situation helfen. Es ist ein großartiges Beispiel dafür, was wir uns von diesem Diskussionsbereich in der JMP-Community für uns alle erhofft haben. Ich bin verblüfft, dass es seit einer Woche keine Aktivität mehr gab. Ich bezweifle, dass das daran liegt, dass die letzte Antwort alle verbleibenden Fragen beantwortet hat.
Ich hoffe, dass die Diskussion wieder Fahrt aufnimmt. Hier sind einige Punkte, von denen ich hoffe, dass sie weitere Antworten hervorrufen:
- Inwiefern ähnelt dieser Fall Ihrem eigenen, wenn Sie Assays entwickeln? Wo ist der Unterschied?
- Gelten für Sie die gleichen Einschränkungen bei der Randomisierung der Läufe (Wells)? Mehr? Weniger? Einfach anders?
- Die Einschränkungen bei der Randomisierung wirken sich eindeutig darauf aus, wie praktisch das Design ausgeführt werden soll. Ist ebenso klar, wie sich die Einschränkung auf die Analyse auswirkt? Was könnte mit meiner Interpretation des Regressionsmodells passieren, wenn die Einschränkung in der Analyse ignoriert wird?
- Welche Praktiken finden Sie beim Entwerfen, Ausführen oder Analysieren eines Experiments mit Einschränkungen hilfreich?
(Beachten Sie, dass es eine weitere verwandte Diskussion gibt, die von demselben Benutzer gestartet wurde. Ich werde diesen Aufruf zum Handeln Cross-Posten und möge die beste Diskussion gewinnen!)
Betreff: Ein Aufruf an JMP-WissenschaftlerIch habe mich mit dieser Frage beschäftigt, weil ich sicher bin, dass es zu diesem Thema einige starke Meinungen gibt. Hier ist eine Möglichkeit, ein 96-Well-Experiment einzurichten.
Dieses Design macht einige Dinge, die ich für nützlich halte.
Im Experiment gibt es kontinuierliche Faktoren:
1. Droge, ein Hemmstoff, den ich studieren möchte
2. Stim, das Ding löst eine Reaktion aus, die das Medikament hemmen soll
3. Der Serumspiegel bewirkt ein besseres Zellwachstum, erhöht jedoch den Hintergrund der Reaktion
und einige kategorische Faktoren:
1. Medientyp
2. Zelllinie, unterschiedliche Zelllinie für jede Platte
Um den Plattenaufbau sinnvoll zu gestalten, möchte ich einige Einschränkungen bei der Randomisierung festlegen. Wenn ich viel Zeit hätte, könnte ich den Pipettierroboter so programmieren, dass er die gesamte Platte vollständig randomisiert. Wenn ich aber nur die Randomisierung beschränke, kann ich die Konzentrationen in den Spalten und in den Reihen gleich halten, und das Ausplattieren wird viel einfacher.
Zunächst einmal habe ich für diesen Umfang im Wesentlichen 384 Wells zur Verfügung, mit denen ich arbeiten kann, 96 pro Platte und 4 Platten (eine für jede Zelllinie). Für die Faktoren, mit denen ich arbeite, kann ich mir leicht die 2. Ordnung ansehen Wechselwirkungen und quadratische Effekte für die kontinuierlichen Terme. Wenn ich die Platten aufstelle, habe ich 12 Spalten und 32 Reihen (8 Reihen für jede der 4 Platten).
Im DOE-Dialog werde ich die Randomisierung für Zeilen und Spalten einschränken. Das bedeutet, dass einige Faktoren „schwer“ und andere „sehr schwer“ zu ändern sind, was es zu einem Split-Strip-Plot-Experiment macht. Ganze Plots entsprechen schwer zu ändernden Faktoren, und Subplots entsprechen sehr schwer zu ändernden Faktoren. Wenn ich also 12 Unterdiagramme und 32 (8x4) ganze Diagramme habe, sind die schwer zu ändernden Dinge (in diesem Fall Medikament und Serum) in den Spalten konstant und jede einzelne Zeile auf der Platte gleich. Lassen Sie mich das etwas näher erläutern. Jede Säule hat eine andere Konzentration, die Konzentration ist in der gesamten Säule gleich. (Super praktisch, wenn Sie Ihre eigenen Platten im Mehrkanal-Pipettierverfahren verwenden.)
Als letztes muss die Platte/Zelllinie berücksichtigt werden. Was ich wirklich brauche, ist ein in drei Richtungen aufgeteiltes Diagramm, sodass Zelllinie/Platte „sehr schwer zu ändern“ wäre, aber das ist keine Option, und es wäre möglicherweise besser, wenn es für jede Platte ein anderes Unterdiagrammmuster für die Spalten gäbe. aber das ist ziemlich gut. (Realistisch gesehen reicht es wahrscheinlich aus, nur 8 ganze Parzellen und 12 Unterplots zu erstellen und für jede der vier Zelllinien das gleiche Plattenlayout zu verwenden, außerdem verringert es die Fehlermöglichkeiten beim Plattenlayout.)
DOE(
Custom Design,
{Add Response( Maximize, "Y", ., ., . ),
Add Factor( Continuous, 2, 25, "Drug", 1 ),
Add Factor( Continuous, 0.02, 0.1, "Serum", 1 ),
Add Factor( Categorical, {"IMDM", "RPMI", "DMEM"}, "Media", 2 ),
Add Factor( Continuous, 5, 50, "Stim", 2 ),
Add Factor( Categorical, {"L1", "L2", "L3", "L4"}, "Plate Number", 2 ),
Set Random Seed( 550796982 ), Number of Starts( 1 ), Add Term( {1, 0} ),
Add Term( {1, 1} ), Add Term( {2, 1} ), Add Term( {3, 1} ), Add Term( {4, 1} ),
Add Term( {5, 1} ), Add Term( {1, 2} ), Add Term( {1, 1}, {2, 1} ),
Add Term( {2, 2} ), Add Term( {1, 1}, {3, 1} ), Add Term( {2, 1}, {3, 1} ),
Add Term( {1, 1}, {4, 1} ), Add Term( {2, 1}, {4, 1} ),
Add Term( {3, 1}, {4, 1} ), Add Term( {4, 2} ), Add Term( {1, 1}, {5, 1} ),
Add Term( {2, 1}, {5, 1} ), Add Term( {3, 1}, {5, 1} ),
Add Term( {4, 1}, {5, 1} ), Add Term( {1, 3} ), Add Term( {1, 4} ),
Add Term( {4, 3} ), Make Strip Plot Design, Set N Whole Plots( 32 ),
Set N Subplots( 12 ), Set Sample Size( 384 ), Optimality Criterion( 2 )
);Betreff: Einrichtung von 96- und 384-Well-Plattendesigns mit ReplikatenIch würde dabei die statistische Versuchsplanung (DOE) und das physikalische Plattenlayout als zwei verbundene, aber separate Schritte betrachten. Sobald die Faktoren, Wechselwirkungen und quadratischen Terme festgelegt sind, können praktische Einschränkungen für Reihen, Spalten, Platten und Replikate hinzugefügt werden, anstatt jede Vertiefung vollständig zu randomisieren. Dies erscheint besonders sinnvoll, wenn einige Variablen von einem Liquid-Handling-System gehandhabt werden können, während andere einfacher manuell oder mit Mehrkanalpipettieren zu handhaben sind.
Bei der Replikation sollte man darauf achten, nicht alle Replikate direkt nebeneinander zu platzieren. Das vereinfacht zwar den Versuchsaufbau, birgt aber auch das Risiko, dass ein lokaler Platteneffekt fälschlicherweise als Behandlungseffekt interpretiert wird. Die Verteilung unabhängiger Replikate auf verschiedene Bereiche der Platte, idealerweise auf separate Platten oder in separaten Läufen, ermöglicht eine bessere Erkennung von Platten-zu-Platten-Variationen. Technische Replikate können weiterhin gruppiert werden, wenn dies aus praktischen Gründen erforderlich ist.
Für einen 384-Well-Assay würde ich vor dem Pipettieren ein physisches Well-Layout erstellen. Eine Vorlage wie beispielsweise für 96 -Well-Platten kann hierbei hilfreich sein, um das Layout einer 384-Well-Platte zu organisieren und Behandlungsbedingungen, Kontrollen, Replikatgruppen sowie Zeilen- und Spaltenpositionen zu markieren. Dieses visuelle Layout neben der Versuchsplanungstabelle erleichtert es erheblich, versehentliche Duplikationen oder fehlerhafte Kontrollplatzierungen zu erkennen, bevor die Platte tatsächlich vorbereitet wird.
Ich würde außerdem separate Vertiefungen für Positivkontrollen, Negativkontrollen und gegebenenfalls eine Referenzbedingung vorsehen. Diese Kontrollen sind besonders wertvoll, wenn man feststellen möchte, ob ein scheinbarer DOE-Effekt tatsächlich auftritt oder teilweise durch Randeffekte, Dosierabweichungen, Verdunstung oder Drift zwischen den Platten verursacht wird. Für das Modell würde ich Terme zweiter Ordnung und biologisch sinnvolle Wechselwirkungen bevorzugen, anstatt automatisch kubische Terme hinzuzufügen, da unnötige Terme höherer Ordnung viele experimentelle Freiheitsgrade verbrauchen können.
