Mise en place de modèles de plaques à 96 et 384 puits avec répétitionsSalut les scientifiques JMP,
Je travaille sur certains projets de développement d'analyses cellulaires dans lesquels j'utilise des DOE pour essayer d'optimiser les paramètres que je peux contrôler dans les expériences.
Configurer les dispositions pour les plaques à 96 et 384 puits pour obtenir un niveau de réplication raisonnable et éviter les effets de bord est un peu pénible. Existe-t-il de bonnes stratégies qui n'impliquent pas de randomiser toute l'assiette avec un robot ? (bien que j'ai un gestionnaire de liquide pour certaines variables qui se prêtent mieux à la randomisation) Quels types de conceptions et quels termes (par exemple interactions, quadratique, cubique ..) est-ce que vous investissez dans les designs ? Comment gérez-vous les « répliques » dans le générateur de conception personnalisée du DOE ? Je suis curieux d'avoir autant de retours que possible. Je comprends la puissance et l'utilité du DOE, je suis un converti, mais j'ai juste besoin d'aide pour enfin lancer cet effort et l'utiliser dans notre développement de tests et notre conception expérimentale quotidiens.
Merci!
Conception d'expériencesRe: Un appel aux scientifiques de JMPDonc, cela ajoute un peu plus de complexité. Une solution pratique à envisager consiste à répéter la même disposition des plaques pour le médicament, le tampon et le sérum, avec des plaques de concentration cellulaire différentes. Ensuite, pour traiter les temps d'incubation, je pourrais préparer plusieurs plaques à chacune des concentrations cellulaires afin de pouvoir extraire les plaques à des moments appropriés.
Bien sûr, la concentration de la cellule. il faudra qu'il y ait au moins trois niveaux pour prendre en charge un terme de modèle quadratique.
Le temps est géré différemment. Je pourrais analyser chaque point temporel séparément, ET j'ajusterais une courbe (Fit Curve) à la réponse en fonction du temps, en dehors de l'analyse DOE. Ensuite, les paramètres de la courbe (comme la pente, l'asymptote, le point d'inflexion/EC50) deviendraient des réponses dans le tableau DOE. S'il n'y a pas déjà d'article sur le paramétrage des données de séries temporelles, ce serait un bon sujet pour quelqu'un (ou moi) plus tard.
Cela peut devenir une expérience assez vaste, mais c'est à cela que servent les robots de pipetage.
Pour la question bonus. Je m'attends à ce que le changement dans les parcelles entières et les sous-parcelles ait peu ou pas d'effet avec si peu de facteurs. Mais comme pour tout, vérifiez d'abord. Réalisez les deux conceptions, puis utilisez l'outil de comparaison de conceptions (DOE/Design Diagnostics).
Re: Un appel aux scientifiques de JMPMerci pour votre contribution très utile !
En utilisant cela, j'ai créé un design qui ressemblerait à ceci :
PlateLayout.PNG
Désormais, faire varier la densité cellulaire sur une plaque est possible mais assez fastidieux car le pipetage des cellules avec un manipulateur de liquide doit être effectué avec soin. En bref : je voudrais faire varier la densité cellulaire entre les plaques mais pas entre les puits. Un autre facteur serait la variation du temps d'incubation (non illustré ici), qui peut également varier uniquement entre les plaques et non entre les puits. Mon approche serait d'utiliser les deux facteurs « factices » comme étant la réalité, à savoir le temps d'incubation et la densité cellulaire, mais cela ne donne pas le bon résultat.Ensuite, je devrais également prendre en compte ces facteurs dans mon modèle, y compris l'interaction et les termes quadratiques. Où est mon erreur ? Ou comment dois-je aborder cela ?
Et, question bonus :
Si je veux laisser de côté les puits de bord pour éviter l'effet de bord, je définirais le nombre de parcelles entières sur 6 et de sous-parcelles sur 10 ?
Merci d'avance!
Re: Un appel aux scientifiques de JMPConstruction de 96 puits d'expérimentation.
Screen Shot 2017-09-12 at 5.09.17 PM.png
Jetez un œil à cette méthode de construction du DOE. Il existe 4 facteurs continus et 2 facteurs continus supplémentaires à utiliser comme variables fictives pour les paramètres difficiles et très difficiles à modifier. (variables factices pour construire l'ensemble et les sous-parcelles.) Les facteurs X3, X4, X5 et X6 sont les facteurs expérimentaux, la conception inclut des termes d'interaction et de modèle quadratique pour chacun d'eux. Facteurs X1 et
X2 sont des effets principaux qui sont définis comme étant difficiles et très difficiles à modifier.
(Traduit de Stat Speak : Si vous disposez d'un robot capable de pipeter une disposition aléatoire de plaques, il serait pratique que votre table DOE contienne également des emplacements de plaques. Dans cet exemple, je vais forcer JMP à me donner les positions des plaques qui seront étiquetées « Sous-parcelle » et « Parcelle entière ». Afin que cela fonctionne, les deux premiers facteurs/variables/entrées/X que j'ajoute seront simplement des mannequins. Rendez le premier X factice difficile à changer et rendez le deuxième X très difficile à changer. À partir de là, ajoutez vos autres variables telles que le médicament, l'inhibiteur, le tampon, le cofacteur, le nutriment, la source de carbone ou tout ce qui vous intéresse. Ensuite, comme d'habitude, ajoutez les termes, comme les interactions et les quadratiques, au modèle. Faites très attention à ne pas inclure les X factices dans les interactions et les termes quadratiques. Tout ce dont nous avons besoin, ce sont les principaux effets.
Cette dernière étape est essentielle pour que cela fonctionne, ne la sautez pas. Il existe une option : "Les facteurs difficiles à modifier peuvent varier indépendamment des facteurs très difficiles à modifier". Cela DOIT être vérifié. Jetez un œil au script et vous remarquerez ceci : "Make Strip Plot Design", dans l'argument. L'activation de cette option fait apparaître ce bit dans le script. (Les statistiques parlent : JMP peut créer des conceptions de parcelles en bandes avec des restrictions sur la randomisation pour des parcelles entières et des sous-parcelles indépendantes les unes des autres.) La partie suivante est également importante. Définissez le nombre de parcelles entières et de sous-parcelles, puis le nombre d'exécutions. L’une des parcelles doit avoir 8 et l’autre 12, et le nombre d’exécutions est de 64. Dans le passé, je n'avais que 8 colonnes réservées à l'expérience, puis j'utilisais les trois dernières pour les contrôles et les courbes standard. Dans ce cas, les parcelles entières et les sous-parcelles valent toutes deux 8 et exécutent = 64. Après avoir créé la table de conception, il ne devrait pas être trop difficile de transmettre la conception à votre robot pour le pipetage.)
Screen Shot 2017-09-12 at 5.14.56 PM.png
Dans la conception générée, JMP fournit les 8 parcelles entières et les 12 sous-parcelles sur deux colonnes qui peuvent être utilisées comme emplacement de chacun des 96 puits. Dans la figure ci-dessous, X3, X4, X5 et X6 n'ont aucune restriction sur la randomisation, et un modèle différent est évident pour chaque variable, représentée par quatre des quatre grilles.
Une fois l’expérience terminée, il sera important de se rappeler de ne pas inclure les deux variables muettes dans le modèle. Par défaut, ceux-ci seront dans le script du modèle.
Script de conception
DOE(
Custom Design,
{Add Response( Maximize, "Y", ., ., . ),
Add Factor( Continuous, -1, 1, "whole plot dummy", 1 ),
Add Factor( Continuous, -1, 1, "sub plot dummy", 2 ),
Add Factor( Continuous, -1, 1, "X3", 0 ),
Add Factor( Continuous, -1, 1, "X4", 0 ),
Add Factor( Continuous, -1, 1, "X5", 0 ),
Add Factor( Continuous, -1, 1, "X6", 0 ), Set Random Seed( 42 ),
Number of Starts( 10 ), Add Term( {1, 0} ), Add Term( {1, 1} ),
Add Term( {2, 1} ), Add Term( {3, 1} ), Add Term( {4, 1} ), Add Term( {5, 1} ),
Add Term( {6, 1} ), Add Term( {3, 1}, {4, 1} ), Add Term( {3, 1}, {5, 1} ),
Add Term( {3, 1}, {6, 1} ), Add Term( {4, 1}, {5, 1} ),
Add Term( {4, 1}, {6, 1} ), Add Term( {5, 1}, {6, 1} ), Add Term( {3, 2} ),
Add Term( {4, 2} ), Add Term( {5, 2} ), Add Term( {6, 2} ),
Make Strip Plot Design, Set N Whole Plots( 8 ), Set N Subplots( 12 ),
Set Sample Size( 96 ), Optimality Criterion( 2 ), Make Design}
);
Re: Un appel aux scientifiques de JMPUne partie de cette réticence pourrait être due au langage que nous utilisons. Peut-être que cela aurait dû être langues . Le scientifique parle de plaques et de puits, de pipetage et de dilution, de temps d'incubation, de concentration, etc. Le statisticien, quant à lui, (indirectement via l'interface utilisateur de JMP pour la conception personnalisée et directement via les réponses ici) parle des types de facteurs, des niveaux de facteurs faciles, difficiles ou très difficiles à modifier, des parcelles entières et des sous-parcelles, du blocage. , et ainsi de suite.
Est-ce que tu as compris tout ça? Probablement pas. C'est normal.
Nous devons donc prendre le temps de nous expliquer aux autres personnes participant à la discussion. Plus le sujet et les problèmes sont avancés, plus des explications sont nécessaires pour communiquer pleinement le problème et la solution.
Re: Un appel aux scientifiques de JMPJe pense que cette question de conception d'un expérience sophistiquée avec des restrictions sur la randomisation est important et, par conséquent, cette discussion pourrait aider de nombreux utilisateurs dans une situation similaire. C'est un excellent exemple de ce que nous espérions que cet espace de discussion au sein de la communauté JMP puisse être pour nous tous. Je suis étonné qu'il n'y ait eu aucune activité depuis une semaine. Je doute que ce soit parce que la dernière réponse répond à toutes les questions restantes.
J'espère que la discussion reprendra. Voici quelques points qui, je l’espère, susciteront davantage de réponses :
- En quoi ce cas ressemble-t-il au vôtre si vous développez des tests ? En quoi est-ce différent ?
- Avez-vous les mêmes restrictions sur la randomisation des analyses (puits) ? Plus? Moins? Juste différent?
- Les restrictions sur la randomisation ont clairement un impact sur la praticité de l’exécution de la conception. L’impact de la restriction sur l’analyse est-il tout aussi clair ? Que pourrait-il arriver à mon interprétation du modèle de régression si la restriction est ignorée dans l’analyse ?
- Quelles pratiques trouvez-vous utiles lors de la conception, de l’exécution ou de l’analyse d’une expérience avec des restrictions ?
(Notez qu'il existe une autre discussion connexe lancée par le même utilisateur. Je vais publier cet appel à l'action et que la meilleure discussion gagne !)
Re: Un appel aux scientifiques de JMPJe me suis caché sur cette question parce que je suis sûr qu'il y a probablement des opinions bien arrêtées sur ce sujet. Voici une façon de mettre en place une expérience à 96 puits.
Cette conception fait certaines choses que je pense utiles.
Dans l'expérience, il y a des facteurs continus :
1. Médicament, un inhibiteur que je souhaite étudier
2. Stim, la chose stimule une réponse que le médicament est censé inhiber
3. Au niveau sérique, les cellules se développent mieux mais augmentent le fond de la réponse
et quelques facteurs catégoriques :
1. Type de support
2. Lignée cellulaire, lignée cellulaire différente pour chaque plaque
Pour rendre la configuration de la plaque raisonnable, je souhaite imposer certaines restrictions sur la randomisation. Si j'avais beaucoup de temps, je pourrais programmer le robot de pipetage pour qu'il randomise complètement la plaque entière, mais si je limite simplement la randomisation, je peux maintenir les concentrations dans les colonnes et dans les rangées de la même manière, et le placage devient beaucoup plus simple.
Tout d'abord, pour le cadre de ceci, j'ai essentiellement 384 puits avec lesquels travailler, 96 par plaque et 4 plaques (une pour chaque lignée cellulaire.) Pour les facteurs avec lesquels je travaille, je peux facilement regarder le 2ème ordre. interactions et effets quadratiques pour les termes continus. Lorsque j'installe les plaques, j'ai 12 colonnes et 32 lignes (8 lignes pour chacune des 4 plaques.)
Dans la boîte de dialogue DOE, je vais limiter la randomisation des lignes et des colonnes. Cela signifie rendre certains facteurs « difficiles » à modifier et d'autres « très difficiles », ce qui en fait une expérience de tracé en bandes divisées. Les parcelles entières correspondent à des facteurs difficiles à modifier et les sous-parcelles correspondent à des facteurs très difficiles à modifier. Donc, si j'ai 12 sous-parcelles et 32 (8x4) parcelles entières, alors les choses difficiles à changer (dans ce cas, le médicament et le sérum) seront constantes dans les colonnes et chaque ligne individuelle sera la même dans toute la plaque. Laissez-moi vous expliquer cela un peu plus. Chaque colonne a une concentration différente, la concentration est la même dans toute la colonne. (Très pratique si vous pipetez multicanal vos propres plaques.)
La dernière chose à considérer est la lignée plaque/cellule. Ce dont j'ai vraiment besoin, c'est d'un tracé divisé en trois voies, donc la lignée cellulaire/plaque serait "super difficile à changer", mais ce n'est pas une option, et il serait peut-être préférable qu'il y ait un modèle de sous-tracé différent pour les colonnes de chaque plaque, mais c'est plutôt bien. (En réalité, créer simplement 8 parcelles entières et 12 sous-parcelles et utiliser la même disposition de plaque pour chacune des quatre lignées cellulaires est probablement suffisant, et cela réduit également les risques d'erreur dans la disposition de la plaque.)
DOE(
Custom Design,
{Add Response( Maximize, "Y", ., ., . ),
Add Factor( Continuous, 2, 25, "Drug", 1 ),
Add Factor( Continuous, 0.02, 0.1, "Serum", 1 ),
Add Factor( Categorical, {"IMDM", "RPMI", "DMEM"}, "Media", 2 ),
Add Factor( Continuous, 5, 50, "Stim", 2 ),
Add Factor( Categorical, {"L1", "L2", "L3", "L4"}, "Plate Number", 2 ),
Set Random Seed( 550796982 ), Number of Starts( 1 ), Add Term( {1, 0} ),
Add Term( {1, 1} ), Add Term( {2, 1} ), Add Term( {3, 1} ), Add Term( {4, 1} ),
Add Term( {5, 1} ), Add Term( {1, 2} ), Add Term( {1, 1}, {2, 1} ),
Add Term( {2, 2} ), Add Term( {1, 1}, {3, 1} ), Add Term( {2, 1}, {3, 1} ),
Add Term( {1, 1}, {4, 1} ), Add Term( {2, 1}, {4, 1} ),
Add Term( {3, 1}, {4, 1} ), Add Term( {4, 2} ), Add Term( {1, 1}, {5, 1} ),
Add Term( {2, 1}, {5, 1} ), Add Term( {3, 1}, {5, 1} ),
Add Term( {4, 1}, {5, 1} ), Add Term( {1, 3} ), Add Term( {1, 4} ),
Add Term( {4, 3} ), Make Strip Plot Design, Set N Whole Plots( 32 ),
Set N Subplots( 12 ), Set Sample Size( 384 ), Optimality Criterion( 2 )
);Re: Mise en place de plaques à 96 et 384 puits avec réplicatsJe préconiserais de considérer la planification statistique des expériences et l'agencement physique des plaques comme deux étapes liées mais distinctes. Une fois les facteurs, les interactions et les termes quadratiques établis, on peut ajouter des contraintes pratiques concernant les lignes, les colonnes, les plaques et les réplicats, au lieu de tenter de randomiser complètement chaque puits. Cette approche s'avère particulièrement utile lorsque certaines variables peuvent être gérées par un système de manipulation de liquides, tandis que d'autres sont plus faciles à gérer manuellement ou à l'aide d'un pipetage multicanal.
Pour la réplication, il convient d'éviter de placer tous les réplicats côte à côte. Bien que cela simplifie la mise en place de l'expérience, cela augmente le risque d'interpréter un effet local de la plaque comme un effet du traitement. Répartir les réplicats indépendants sur différentes zones de la plaque, et de préférence sur des plaques ou des séries distinctes, permet de mieux détecter les variations entre plaques. Les réplicats techniques peuvent être regroupés lorsqu'il existe une raison pratique de le faire.
Pour un test sur plaque 384 puits, je recommande de créer le plan physique des puits avant le pipetage. Un outil comme le gabarit de plaque 96 puits peut s'avérer utile pour organiser la disposition des puits, en indiquant les conditions de traitement, les contrôles, les groupes de réplicats et les positions des lignes et des colonnes. Ce plan visuel, placé à côté du tableau des plans d'expériences, facilite grandement la détection des duplications accidentelles ou des erreurs de placement des contrôles avant la préparation de la plaque.
Je prévois également des puits dédiés aux contrôles positifs, aux contrôles négatifs et éventuellement à une condition de référence. Ces contrôles s'avèrent particulièrement précieux pour déterminer si un effet apparent de la planification d'expériences est réel ou s'il est partiellement dû à des effets de bord, à des variations de distribution, à l'évaporation ou à la dérive inter-plaques. Concernant le modèle, je privilégierais les termes du second ordre et les interactions biologiquement pertinentes plutôt que d'ajouter automatiquement des termes cubiques, car des termes d'ordre supérieur inutiles peuvent réduire considérablement les degrés de liberté expérimentaux.
